细胞学.动物组织与细胞培养.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * （6）分离细胞 1、离心：脱离微载体的细胞培养液放入容器，离心沉淀微载体（400r／min，2分钟）收集细胞。 2、过滤：还可用过滤方法，采用直径100μm孔径的尼龙网、不锈钢网等可将细胞与微载体分离开。 （7）传代培养 微载体上分离下来的细胞可进一步做微载体传代培养。 1、可在细胞脱离微载体后，转接细胞，加入一些新的微载体以增大培养体积。 2、另一种放大培养方法：也可在微载体长满细胞后直接加入微载体,更换培养基。 Microcarriercultures (四)微囊化培养（microcapsule culture） 微囊是用一种人造的半透膜制成的多孔微球体，小分子物质可以自由透过，而各种酶、辅酶、离子交换剂、活性炭及蛋白等大分子物质包裹在其中不能逸出； 细胞生长在各自的微小环境里受到一定的保护。 减少了搅拌对细胞产生的剪切力 由于环境的改善，细胞得到很好的生长，代谢产物浓度增加，纯度提高。 制备动物细胞微囊所用的材料，主要是海藻酸（ALG）和多聚赖氨酸（PLL）. 海藻酸和多聚赖氨酸分子量的大小及其溶液的浓度；细胞与海藻酸钠混合的时间；溶液的pH，温度等都会影响微囊膜直径的大小. 微囊制作 1）分离好的细胞悬浮在1.0％～1.2％的海藻酸钠液中，细胞终浓度达到1×107cells／ml； 2）细胞悬浮液经微囊发生器制成微滴，将微滴加入1.3%CaCl2溶液后成凝胶球，10分钟后，去除上清收集胶球; 3）加入0.05％的聚赖氨酸，微球胶体颗粒表面包裹一层膜。 例1:应用微囊化方法培养杂交瘤细胞时，微囊膜孔径大小控制截留8×104D以内的分子量，免疫球蛋白IgG（杂交瘤细胞产生的单抗）的分子量为1.5×105D。 当细胞生长稳定，达到6×107 cells／ml培养液时，抗体的产量可高达1.5mg／ml。 例2:将分离的胰岛细胞培养1～3天后，按1.75×103 cells／ml浓度悬在1.5‰海藻酸钠溶液中制成微囊，按4×103个微囊／只老鼠，腹腔植入培养一段时间后，老鼠血糖下降,保持了一年。 二、影响动物细胞体外培养的环境因素 1、培养温度 哺乳类细胞的最适培温度37℃，鸡细胞在39～42℃，昆虫类细胞25～28℃，冷水鱼细胞23℃，温水鱼26℃。 细胞对低温的耐受力强于高温，有人做过实验： 放在45℃温度下，1小时死亡； 放在41～42℃下，10～24小时细胞退化或死亡； 放在在25～35℃时，细胞缓慢生长， 放在4℃下几小时后再放入37℃下培养，细胞仍能生长。 2、培养液的pH值 大多数动物细胞都适合在pH7.2～pH7.4范围内生长. 原代培养细胞对pH值要求较严，传代培养细胞对pH值要求较宽。 细胞对偏酸环境的耐受性要强于偏碱环境。 通常是在培养液中加入一定量的磷酸缓冲液（PBS），保持培养液的pH值相对稳定。 或用羟乙基呱嗪乙烷磺酸（HEPES）氢离子缓冲液。 3、溶氧水平 细胞生长离不开氧气的供应，培养初期细胞数量少，可以控制较低水平的溶氧量。 随着细胞数量的增多，营养物质的消耗，加大溶氧量。 对大多数动物细胞来说，培养过程中对氧的消耗速率范围是： 4.5×10ˉ12～4.8×10 ˉ12 g／（cell●h）。 4、培养液渗透压 培养液的渗透压是指用以阻止细胞水分子通过半透膜进入培养液的压力，其大小与其浓度成正比。 原代培养的细胞一般对渗透压的波动较敏感，而细胞株和细胞系则耐受性较大。 培养液需要一定的渗透压。 三、 动物细胞培养的关键技术 （1）细胞培养环境 氨离子：动物细胞体外培养中氨离子的积累是抑制细胞生长的主要因素之一。 乳酸：它是细胞糖代谢的产物。高乳酸浓度必将抑制细胞生长。 二氧化碳：随着细胞培养规模和培养密度的增大，二氧化碳积聚会对细胞产生毒性作用或者改变细胞代谢水平。 甲基乙二醛：主要是丙糖磷酸去除磷酸基后的代谢产物，也是脂类、和氨基酸代谢的产物，对于细胞有潜在的损伤作用。 渗透压：高渗透压不仅影响细胞分批培养中抗体产量，还影响细胞生长速度、对数生长期的长短、细胞死亡的速度。 在培养基中加入诸如甘氨酸、甜菜碱、或脯氨酸等渗透压保护剂在一定程度上能减轻高渗透压对细胞的生长抑制作用。 * * * * * * * * * * * 第二节 动物细胞培养 一、 动物细胞培养类型 (一)细胞原代培养 1.取材分离 取出组织块放入小烧杯中，用尖嘴剪刀将组织块剪碎成1mm3大小，加入Hanks液（平衡盐水BSS） ，冲洗数次。 取材分离 2.组织消化： 是用酶法将剪碎的组织块分散成细胞团或单细胞。 将剪碎的组织块放入三角烧瓶中，加入30～50倍体积的0.25％浓