akp活性命检测27日.pptVIP

QA 关于噬菌体污染 表达产物AKP蛋白的检测 1. 菌体加入15mL匀浆液 2. 超声破碎： 输出功率1200w，超声2秒， 间隔10秒，超声次数：40次 3. 粗匀浆制样： 细胞破碎液 200uL ＋ 4x 样品处理液100uL + 匀浆缓冲液100uL 90℃变性5min，室温保存准备SDS电泳用。 4. 匀浆上清制备：另取1.0 mL细胞破碎液，4℃, 12000rpm×10min离心，留上清液 5. 上清液制样：匀浆上清 200uL ＋ 4x 样品处理液100uL + 匀浆缓冲液100uL ，90℃变性5min，室温保存准备SDS电泳用。 SDS的 浓 缩 效 应 电泳体系为不连续体系 电泳缓冲液与凝胶中的缓冲液不同 凝胶也由PH、凝胶孔径均不相同的两层胶组成 电荷效应：Cl－的快速泳动在其后面形成低电导、高电压梯度区带动Pr－和Gly－快速泳动，这样在高电压与低电压区形成界面，Pr－浓缩成狭小薄层 SDS的变性作用 SDS在溶液中能破坏蛋白质分子内和分子间的非共价键 β－巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT)的作用使蛋白质分子中的二硫键打开 ∴ 二者的作用使蛋白质变成单亚基并结合上SDS形成蛋白质－SDS复合物 由于SDS带有大量的负电荷，掩盖了蛋白质原有的电荷 SDS与蛋白质的结合，改变了蛋白质原有的构象，变成了近似于长椭圆棒，其短轴