雌雄性止细胞的分离技术.pptVIP

第十三章 雌、雄性细胞的分离技术 13.1引言 性细胞：狭义、广义 性细胞：直接参加受精作用的雌、雄配子（卵细胞与精细胞）、花粉原生质体、脱外壁花粉、胚囊。（合子、初生胚乳核） 13.2花粉原生质体与脱外壁花粉的分离 花粉粒 脱外壁花粉 花粉原生质体 13.2.1花粉原生质体 80年代中期三条分离路线： 1、化学脱壁：Southworth（1974） Loewus等（1985）多糖试剂MMNO 2、酶法脱壁：Tanaka等（1987）麝香百合成熟花粉的原生质体 周嫦（1988）鸢尾、萱草、风雨花成熟花粉原 生质体和萱草幼嫩花粉原生质体 3、非酶法脱壁：Weaver等（1990）NaCl溶液滴加于菜豆成熟 花粉 四种分离方法： 1、一步酶解法 麝香百合、鸢尾、风雨花的成熟花粉以及萱草不同发育时期的花粉原生质体； 单子叶植物百合科、鸢尾科、石蒜科等，双子叶植物芸薹属。 适用于具宽大萌发沟花粉的植物 过程：花粉 酶液 水合膨胀 外壁沿萌发沟裂开，内壁大面积地暴露 酶的作用下分解 释放出原生质体 2、水解-酶解二步法 分两步：花粉在溶液中充分水合，是外壁裂开， 转入酶液，降解内壁，获得原生质体 甘蓝型油菜与紫菜薹成熟花粉、凌霄花 四种分离方法： 3、萌发-酶解二步法 分离烟草等植物的花粉原生质体 汪泳与周嫦（1995）建立 步骤： 成熟的花粉置于花粉萌发培养基中，待花粉大量萌发，长出短花 粉管时及时转入酶液中酶解。 酶液降解花粉管壁，再扩展至花粉内壁，释放出原生质体 注意：花粉管过长时，形成亚原生质体。 4、花药预培养法 分离烟草幼嫩花粉原生质体，夏慧君等（1996）建立 三步：花蕾低温预处理 收集花药，将其漂浮在液体培养基上，培养中花药裂开， 花粉释放到培养基中，继续培养，大量的花粉外壁裂开 。 将裂外壁花粉转入酶液。内壁被酶降解，外壁脱落，游离 出花粉原生质体。 小结： 根据不同植物花粉及其花粉壁的特点采取不同的分离方法。 根据不同花粉发育时期，其形态结构与生理状态的不同而用不同方法。 分离方法与其细节可影响分离效果。如酶的种类、酶解时间、温度、浓度等。 13.2.2脱外壁花粉 三种分离方法 1、低渗水合法： 将花粉置于低渗溶液中水合，使外壁脱落。芸薹属、风雨花、荷花。 2、花药预培养法： 烟草幼嫩花粉原生质体法衍生 三步：花蕾低温预处理-花药漂浮培养-酶解 酶解时间短 3、低温水合-热激-渗激法 芸薹属脱外壁花粉分离的方法，分离出青菜与紫菜薹脱外壁花粉 三步：将花粉置于水合液中，低温下较长时间水合——消除内外 壁的联系，较好地保持花粉的生活力 将花粉转入较高温度下作短时热激处理 再转入低渗溶液，作短时震荡渗激处理。 13.3生殖细胞与精细胞的分离 两类分离方法： 机械分离法 渗透压冲击法 13.3.1生殖细胞 四种分离方法： 1、一步渗透压冲击法 花粉置于低渗蔗糖溶液中保温一段时间后，花粉自行破裂，生殖细胞随营养细胞质流出。 棉花生殖细胞 适用于花粉容易在蔗糖溶液中破裂的植物 2、二步渗透压冲击法 适用于花粉容易萌发的植物 将花粉置于等渗蔗糖溶液中培养，当大部分花粉开始萌发时，加入蒸馏水使渗透压骤降，导致花粉管尖端破裂，释放出生殖细胞。 蚕豆、石蒜、风雨花、玉帘、烟草、凤仙花等 四种分离方法： 3、低酶法 将花粉置于低浓度的酶溶液与低渗蔗糖溶液中保温，促使花粉破裂释放出生殖细胞。 黄花菜、韭菜、朱顶红、唐菖蒲、鸢尾等 4、花粉原生质体释放法 分离出花粉原生质体，用渗透压冲击法或机械法使花粉原生质体破裂，获得生殖细胞。 麝香百合分离出生殖细胞 黄花菜、韭菜、鸢尾、唐菖蒲、朱顶红、风雨花等分离出花粉原生质体 局限性在于许多植物花粉原生质体尚未分离成功。 13.3.2精细胞 三细胞花粉的精细胞分离： 1、渗透压冲击法 将花粉置于含一定浓度渗透压调节剂的介质中，任其吸水后自行破裂而释放精细胞。 白花丹、玉米、小麦、甜菜等 优点：花粉壁不太