基因工程法获取人胰岛素 2005级生命科学基地班 呢 王常丽 阚洪囡 石倩 苑新星.pptVIP

1．5％低熔点琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物，然后用EcoR Ⅰ和BamHⅠ 双酶切，回收后与pJGl03(含B—C—A人胰岛素原基因)载体大片段连接(经EcoR Ⅰ和BamHⅠ双酶切后回收)，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α． 1．2．2 质粒pJGll2的筛选和鉴定 酶切筛选：将转化出的单菌落采用常规小量质粒制备方法制备质粒DNA，取1μg DNA，用EcoR I和BamH I双酶切后进行1．5％琼脂糖凝胶电泳，凡有约380bp片段出现的重组克隆作序列分析鉴定． 温度诱导表达筛选：挑取转化的单菌落，37 ℃培养过夜，次日扩大10倍37℃培养3 h，42℃诱导4—6 h。离心得菌体，适量无菌水悬浮后，取适量菌体悬浮液进行15％SDS—PAGE，以pBV220和pJGl03转化菌液作为对照． DNA序列测定：采用izard?plus Minipreps DNA purification System提取测序模板，采用Sanger双脱氧终止法，测序反应按Pharmacia公司T7SequencingTMKit说明书进行．6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析． 1．2．3 Met—Lys—双C肽人胰岛素原基因的摇瓶表达 挑取单菌落于3 ml LB Amp+培养液中，37℃培