C5-1 基因操作中大分子分离和分析.pdfVIP

第五章 基因操作中大分子 第五章 基因操作中大分子 的分离和分析 的分离和分析 5.1 DNA的分离和纯化 5.1 DNA的分离和纯化 5.2 RNA的分离和纯化 5.2 RNA的分离和纯化 5.3 凝胶电泳 5.3 凝胶电泳 5.4 分子杂交 5.4 分子杂交 5.1.1 DNA制备基本步骤 5.1.1 DNA制备基本步骤 准备材料 准备材料 裂解细胞 裂解细胞 分离、提取DNA 分离、提取DNA 纯化、浓缩 纯化、浓缩 DNA提取 DNA提取 酚抽提 酚抽提 酒精沉淀 酒精沉淀 柱层析 柱层析 细菌中质粒DNA提取的基本原理 细菌中质粒DNA提取的基本原理 碱裂解法: 细菌染色体DNA和质粒DNA在碱性条件下 碱裂解法: 细菌染色体DNA和质粒DNA在碱性条件下 均会发生变性，由于质粒DNA分子比染色体DNA 均会发生变性，由于质粒DNA分子比染色体DNA 的分子小得多，所以当溶液的pH成为中性时，质 的分子小得多，所以当溶液的pH成为中性时，质 粒DNA容易复性，染色体DNA 由于结构复杂、分 粒DNA容易复性，染色体DNA 由于结构复杂、分 子量大故不能复性，而与细胞碎片、变性蛋白、 子量大故不能复性，而与细胞碎片、变性蛋白、 多糖等形成复合物一同沉淀。 多糖等形成复合物一同沉淀。 变性与复性步骤操作均需温和，以免染色体DNA 变性与复性步骤操作均需温和，以免染色体DNA 断裂成为与质粒DNA分子大小差不多的片段分 断裂成为与质粒DNA分子大小差不多的片段分 子，从而导致出现染色体DNA污染。 子，从而导致出现染色体DNA污染。 质粒DNA的纯化 质粒DNA的纯化 RNase A处理，除去RNA。 RNase A处理，除去RNA。 酚/氯仿抽提，除去蛋白质。 酚/氯仿抽提，除去蛋白质。 酒精沉淀，70% 酒精洗涤，可除去盐离 酒精沉淀，70% 酒精洗涤，可除去盐离 子， TE （Tris-HCl/EDTA）缓冲液或水溶 子， TE （Tris-HCl/EDTA）缓冲液或水溶 解DNA。 解DNA。 试剂盒（kit ）纯化，简便快速，且获得的 试剂盒（kit ）纯化，简便快速，且获得的 质粒DNA的质量高。 质粒DNA的质量高。 基因组DNA提取的基本原理（ CTAB法） 基因组DNA提取的基本原理（ CTAB法） CTAB （hexadecyltrimethylammonium bromide） CTAB （hexadecyltrimethylammonium bromide） 是一种表面活性剂，可使膜蛋白、核蛋白变性， 是一种表面活性剂，可使膜蛋白、核蛋白变性， DNA释放到溶液中。在高盐（1M NaCl）条件下， DNA释放到溶液中。在高盐（1M NaCl）条件下， DNA 与CTAB结合溶于水中，当溶液中盐浓度降低 DNA 与CTAB结合溶于水中，当溶液中盐浓度降低 时（0.5M NaCl ），DNA与CTAB复合物会沉淀下 时（0.5M NaCl ），DNA与CTAB复合物会沉淀下 来。 来。 该法获得的DNA纯度较高，多糖物质污染较少。但 该法获得的DNA纯度较高，多糖物质污染较少。但 产率可能较低。 产率可能较低。 在加入液氮研磨样品至加入抽提液抽提DNA这段时 在加入液氮研磨样品至加入抽提液抽提DNA这段时 间内的操作宜迅速，防止解冻后细胞内释放的 间内的操作宜迅速，防止解冻后细胞内释放的 DNase降解DNA。 DNase降解DNA。 CTAB法 CTAB法 上：水稻基因组DNA 下：水稻基因组DNA酶切