第三章基因克思隆的酶学基础.pptVIP

第三章 基因克隆的酶学基础 第一节 限制性核酸内切酶 第二节 DNA连接酶 第三节 DNA聚合酶 第四节 DNA及RNA的修饰酶 第五节 核酸外切酶 第六节 单链核酸内切酶 第一节 限制性核酸内切酶与DNA分子的体外切割 一、寄主控制的限制与修饰 二、Ⅱ型限制酶的特点 三、影响内切酶活力的因素 四、核酸内切酶对DNA的消化作用 五、 限制酶的用途 一、寄主控制的限制与修饰 人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。 细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉。 限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。 各种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源DNA存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自身的DNA不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的DNA进行了修饰，限制性酶对修饰过的DNA不能起作用。 反应只需Mg2+的存在，并且具有以下两个特点， 识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也在这一回文对称结构上。 许多Ⅱ型酶切割DNA后，可在DNA上形成粘性末端，有利于DNA片段的重组。 二、限制性内切酶的特点1、定义、命名 （1）定义 广义指上述三个系统中的限制酶； 狭义指II型限制酶。 （2）命名 限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。 　例如：HindⅢ　　前三个字母来自于菌种名称H. influenzae，“d”表示菌系为d型血清型（菌株号）；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。 EcoRI—Escherichia coli RI 2、限制酶的特点 （2）识别顺序和酶切位点 ① 识别４-8个相连的核苷酸 Mbo I NGATCN Ava II GG(A/T)CC BamH I GGATCC PpuM I PuGG(A/T)CCPy ② 对称性 ③ 限制酶切后产生两个末端，末端结构是5’-P和3’-OH （3）末端种类 ① 3’-端突起，个数为2或4个核苷酸 Pst I 5’-CTGCAG-3’ 5’-CTGCA G-3’ 3’-GACGTC-5’ 3’-G ACGTC-5’ ② 5’-端突起，个数为2或4个核苷酸 EcoRI 5’-GAATTC-3’ 5’-G AATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’ 3’-CTTAA G-5’ ③?平齐末端 SmaI 5’-CCCGGG-3’ 5’-CCC GGG-3’ 3’-GGGCCC-5’ 3’-GGG CCC-5’ ④ 非互补的粘性末端 切点在识别顺序之外的，如：FokI Fok I 5’-GGATG(Ｎ)9-3’ 5’-GGATG(N)9 3’-CCTAC(Ｎ)13-5’ 3’-CCTAC(N)13 能识别简并顺序的，如：AvaI AvaI 5’-CPyCGPuG-3’ CCCGGG、CTCGGG、CCCGA、CTCGAG （4）异源同序酶（isoschizomer，同裂酶） ① 定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制酶 ② 特点： 识别相同顺序 切割形成相同的末端 KpnI GGTACC SstI CCGCGG Asp718 GGTACC SacI CCGCGG （6）限制片段末端的连接作用 三、影响内切酶活力的因素 （1）DNA的纯度 污染的蛋白质、酚、氯仿、酒精、EDTA、SDS以及高浓度的盐离子等都有可能抑制核酸内切酶活力。 提高效率的方法： ① 增加核酸内切酶的用量 ② 扩大反应体积，使潜在因素被稀释 ③ 延长酶催化时间 （2）DNA的甲基化程度 基因克隆中采用失去甲基化酶的大肠杆菌菌株制备质粒DNA。 （3）酶切消化的反应温度 大多数核酸内切酶的反应温度在37℃，有些酶例外。（表 3-7） 酶活力单位： 一个活性单位（U），是指在50?l反应体系中，37oC的条件下，经过1小时的反应时间，将1?g DNA 完全酶解所需要的酶量。 （4）DNA的分子结构 DNA分子