第二章蛋时白质的检测和分离.ppt

第三章 蛋白质的分离提纯及检测 第一节 引言 一、蛋白质的存在 蛋白质存在于所有的生物细胞中，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。 一般蛋白质，酶、抗体、激素蛋白、毒素蛋白等 存在部位 器官、组织、体液 胞内、胞外 一、蛋白质的存在 存在形式 游离状态 消化液中的蛋白 结合状态 蛋白与蛋白 蛋白与非蛋白 二、为什么要分离提纯蛋白质? 1、农业生产的需要 (1)对农副产品的综合利用需要高活性的酶制剂。 (2)用酶分析法测定家畜家禽以及农作物中某种物质的含量，需要用高纯度的酶制剂。 二、为什么要分离提纯蛋白质? 2、工业生产的需要 食品、发酵、纺织、制革等工业，需要大量的高活性的酶制剂。 淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、溶菌酶、葡萄糖异构酶 二、为什么要分离提纯蛋白质? 3、医疗上的需要 人尿激酶治疗脑血栓 用猪心细胞色素C治疗脑震荡心力衰竭 用猪胰岛素治疗糖尿病 二、为什么要分离提纯蛋白质? 4、蛋白质结构与功能研究及基因工程研究的需要 均一的蛋白制剂 工具酶 高纯度的标准蛋白 三、对蛋白质分离提纯的要求 1、纯度 决定于研究的目的和应用上的要求 2、活性 要求蛋白质保持天然构象状态，有高度的生物活性 3、收率 收率越高越好 提纯步骤愈多，则损失愈大 作为均一制剂，一般收率在5-20％，最高可以达到50％左右。 四、蛋白质分离提纯的一般程序 准备工作： 1、选材，处理； 2、建立适当的细胞破碎和蛋白质抽提方法； 3、建立一系列的分离提纯和浓缩的方法； 4、建立灵敏而方便的分析方法，以估计每一个分离提纯步骤的提纯倍数和收率； 5、建立鉴定纯度的方法(如：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦等)，以鉴定蛋白质制剂的纯度。 四、蛋白质分离提纯的一般程序 蛋白质分离提纯的四个阶段： 第一阶段(前处理)： 选材，破碎，抽提，离心分离，得无细胞抽提液。胞外蛋白不须细胞破碎。 第二阶段(粗分级)： 根据不同蛋白质的溶解度差异，采用适当的沉淀法，对所需蛋白质进行初步的分离提纯。 如：盐析法、等电点法、有机溶剂沉淀法、选择性变性法，以及选择性沉淀法等。 适合于处理大量的样品溶液。 四、蛋白质分离提纯的一般程序 第三阶段(细分级)： 经过粗分离得到的蛋白质制剂是不纯的 细分级可以采用适当的柱层析法。 如：离子交换柱层析(DEAE-纤维素、CM-纤维素)、分子筛层析(Sephadex)、吸附层析(羟基磷灰石)、疏水吸附层析、亲和层析、抗原抗体法等。 柱层析法对蛋白质的分离提纯效果很好，但不能处理大量的样品溶液 制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳，或蔗糖密度梯度等电聚焦法进一步提纯。 此二法只能处理少量样品，所以在提纯的后期使用，比较合适。 采用结晶法对蛋白质进一步提纯。 蛋白质制剂必须达到较高纯度才能进行结晶。所以，结晶法是在提纯的后期使用的。 四、蛋白质分离提纯的一般程序 第四阶段(质量鉴定)：纯度、浓度 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦法、超离心沉降法、免疫电泳法、酶活力法、蛋白质化学结构分析法等。 一般需要用两种或更多的方法鉴定蛋白质制剂的纯度。 经常使用Folin-酚法，双缩脲法、紫外吸收法考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度。 酶需要测定比活力及酶溶液的蛋白质浓度。 四、蛋白质分离提纯的一般程序 防止蛋白质变性的措施： 1、低温(0℃一4℃)操作，防止热变性和蛋白水解酶水解。 2、严格控制pH值，防止过酸过碱对蛋白质的变性作用。 3、搅拌要缓慢，防止泡沫表面张力引起蛋白质变性。 四、蛋白质分离提纯的一般程序 防止蛋白质变性的措施： 4、防止蛋白质自发变性，可以采取下列措施： (1)加入低分子量物质(如蔗糖和甘油等)或加入纯化的蛋白质(如牛血清白蛋白、明胶等)，以提高蛋白质浓度，减少水的伤害。 (2)少数蛋白质必须在高离子强度的极性介质中才能保持活性，可以加KCI，或NaCl，(NH4)2SO4。 (3)有的蛋白质需要加入二价金属离子(如Mg2+、Ca2+等)才能保持稳定性。 (4)某些酶的提纯和保存，需要加入底物，才能稳定。 四、蛋白质分离提纯的一般程序 需要额外注意的两个问题： 天然构象的保持 多亚基多功能寡聚酶 第二节 前处理 一、材料的选择 二、细胞破碎 三、抽提 第二节 前处理 一、材料的选择 选材的原则是： (1)材料中所需蛋白质的含量要高； (2)材料易得。 一、材料的选择 材料中蛋白质含量的多少与下列因素有关： 种属差异，如人与牛的同一种蛋白质，其含量常常相差十倍之多； 个体差异，在不同个体中，蛋白质含量也有明显的不同； 由于性别、年龄、季节、饲料条件的不同，蛋白质的含量也会发生变化。 一、材料的选择 从实验动物体内取材时，要注意三点： (1)要注意动物本身的生理特征； (2)要尽可能在接近