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影响体外受精效果的因素 历史与背景 1878年，德国科学家Schenk将体内成熟的家兔和豚鼠卵子与附睾精子放入子宫液中培养，观察到第二极体排出和卵裂现象。 1944年，Pock和Menkin进行人卵的体外受精实验。 1945年，美籍华人张明觉成功进行了兔的体外受精实验。 1959年，美籍华人张明觉利用获能处理的家兔精子进行体外受精实验，获得了世界上第一批体外受精的试管小兔。 IVF的意义 可利用屠宰场的卵巢生产大量价廉质优的胚胎，可解决胚胎移植的胚胎来源问题。 可使因生殖道疾病而无繁殖能力的优良母牛仍能繁殖一定数量的后代。 可结合活体采卵技术，充分发挥优良母牛的繁殖潜力。 可开发利用大量的腔前卵母细胞，进一步挖掘良种母牛的繁殖潜力。 IVF的意义 可使未成熟的牛犊繁殖后代，大大缩短育种的世代间隔。 可结合精子分离技术生产预知性别的胚胎，达到了控制性别的目的。 可为核移植和基因转移提供丰富的实验材料和必要的辅助手段，加速其研究的进展。 可作研究的手段，加深人们对卵母细胞发生与成熟，精子的获能与受精以及胚胎的早期发生等理论问题的认识. 体外受精技术 由卵母细胞成熟 精子获能 受精 受精卵体外培养 胚胎移植 程序组成的完整系统. 精子获能capacitation 一般认为，雄性动物产生的精子必须在雌性生殖道内停留一定的时间，发生一 定的生理变化后才能具备受精能力。此过程称为精子获能。 精子的获能过程是多时相，多步骤的复杂过程。 获能阶段 第一阶段： 获能的第一阶段是脱出精子 表 面 的 抗 原 物 质 和 去 能 因 子 ，增强了膜通透性。此过程在一定程度是可逆。 第二阶段： 是精子细胞膜蛋白变化，即发生顶体反应。此过程是不可逆的结构上的获能。 精子获能方法有 两 种：即体内获能和体外获能。 休内获能 是从交配母畜的子宫内冲取精子用于受精。 体外获能 分两步： 一： 精子洗涤。离心以除去杂质，精清，死精子，低活力的精子，冻精保护液及稀释液。 二：获能处理，主要是使用离子强度液（His)，钙离子载体，肝素（10—100ug/ml, 15min)等。 精子体外获能的主要方法 高渗溶液处理法：受精前用360mOm的高渗溶液处理精子30分钟，然后进行受精。 肝素处理法：用含100mg/ml肝素的受精液。 用Ca2+载体A23187提高精子内部Ca2+的浓度。 与血清白蛋白的溶液长时间孵育 与含有卵泡液的培养液进行孵育 体外受精的培养系统 目前通常采用的受精系统由微滴法和微孔板法。 微滴法：液滴体积通常为30～50ml，上覆石蜡油。该法的优点是受精效果好，精子利用率高；缺点是需用石蜡油，比较麻烦。 微孔板法：受精液体积通常为0.5～0.8ml，上覆石蜡油或不加石蜡油。该法的优点是操作简单，一次可受精大量的卵子；缺点是精子的利用率相对较低，受精后的胚胎发育率也不如微滴法好。 卵母细胞体外受精的评定 体外培养： 受精后48小时可检查其受精分裂率，体外培养7天后检查囊胚发育率，培养9天后，检查囊胚的孵化率。 卵子体外受精的影响因素 精子的来源 取自附睾的精子比体外采集的精子容易在体外诱发获能，故通常可获得较高的受精率。 来自不同公畜的精液在活力、获能及顶体反应的难易程度上均存在明显差异。 不同公畜个体精子的受精分裂率有差异，但其胚胎发育率的差异则更为明显。 同一公畜个体在不同季节采集的精液，其体外受精效果无明显差异。 受精滴中精子不同平衡时间 以加入精子时间为0h(对照组),分别在0h,0.5h,1h,2h,4h随机加入等数卵母细胞到各受精滴,结果显示:0h,0.5h组卵裂率较高,分别为87.7%、84.7%,与其他组相比差异显著(P0.01);0.5h组的囊胚率最高,为67.5%,与对照组的57.7%比较差异显著(P0.01)。结果表明,受精滴中精子经过0.5h平衡后,弱精及死精粘聚沉淀,余下活力强的健壮精子,此时加入牛卵母细胞受精,可获得较高卵裂率及囊胚率。 (文国艺,阳年生;1999年月11月) 受精液及其成分 受精液必须有利于精子的获能和卵子第二次成熟分裂的完成。故通常为成分较为简单的生理盐溶液。 最为常用受精液通常为TALP和BO，其渗透压一般为285～295mosm，内含10mM的乳酸钠、1mM的丙酮酸钠和2mM的Ca2+，其中Ca2+ 起关键作用。BO液中的NaHCO3浓度高达35.7 mM，不含Hepes，主要用于用A23187作为获能剂的受精液。TALP的NaHCO3浓度通常为25～30 mM，内含5～10m