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基因工程制药 第一节 概述 一、基因工程建立的基础 二、基因工程的相关概念及相关酶学 三、基因工程技术所生产的药物 四、基因工程制药的优点 五、基因工程制药所使用的生物技术 六、我国基因工程制药的进展 七、基因工程制药生产的化学工艺学要求 八、基因工程的发展 三、基因工程技术所生产的药物 传统方法很难生产的，主要是药用活性蛋白质和多肽类，包括： （1）免疫蛋白质----各种抗原、单克隆抗体、乙肝疫苗。 （2）细胞因子----各种干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子、表皮生长因子、凝血因子、促红细胞生成素。 （3）激素----胰岛素、生长激素、心钠素、人脑激素。 （4）酶类----尿激酶、链激酶、葡聚糖酶、组织型纤维蛋白溶解酶原激活剂、超氧化物歧化酶、a-淀粉酶、凝乳酶、人溶菌酶、胰蛋白酶抑制剂。 四、基因工程制药的优点 （1）利用基因工程技术可以生产出过去难以获得的生理活性蛋白和多肽。 （2）可以通过大批量的生产方法获得足够数量的生物活性物质。 （3）利用基因工程技术可以发掘出更多的内源性生理活性物质。 （4）利用基因工程技术和蛋白质工程技术可以对药物蛋白进行修饰和改造，来提高药效价值和获得新型的化合物。 五、基因工程制药所使用的生物技术 （1）DNA重组技术 （2）淋巴细胞杂交瘤技术 （3）细胞培养技术 （4）克隆表达技术 六、我国基因工程制药的进展 α-1b型基因工程干扰素，是我国自行研究开发的具有国际先进水平的基因工程药物，于1997年通过III期临床，并获得国家一类新药证书。它源于中国人基因，最适于黄种人使用。 目前，我国已经批准了12种基因工程药物和疫苗上市。 1、同种限制性内切酶产生的粘性末端连接 2、 同尾酶产生的粘性末端连接 3、不同限制性内切酶粘性末端的连接 4、人工粘性末端的连接--5’突出末端 5、人工粘性末端的连接--3’突出末端 6、粘性末端的添加与更换，利用人工接头Linker 二、接（体外重组） （一）重组率--含有外源DNA的重组分子数/载体分子总数 （二）重组特性： 粘性末端的重组率大大高于平末端。 双酶切片段与载体的重组率高于单酶切片段与载体。 （三）提高重组率的方法 1、加大外源基因片段与载体的比例 2、选择基因序列固有的酶切位点 3、在利用PCR扩增基因的同时引入酶切位点 4、利用中间载体提供酶切位点 1、加大外源基因片段与载体的比例 （1）外源基因片段与载体的比例为5:1--10:1 （2）5’ 末端去磷酸化 2、 选择基因序列两侧固有酶切位点 选用酶切位点,不能在基因序列内部 双酶切产生粘端连接单酶切 粘端连接平端连接 3、在利用PCR扩增基因的同时引入酶切位点 利用PCR扩增基因时，在引物序列中加入特定的限制性酶切位点序列，在扩增基因的两侧就带有了该特定酶切位点。 4、 利用中间载体提供酶切位点 例：Taq酶特点，常会在3’末端添加一个脱氧腺苷酸（A），因此，为克隆PCR产物，设计一个特殊的载体--T载体， 其特点是3’末端含有一个脱氧胸腺苷酸（T）。PCR产物可以不经过酶切直接与T载体连接，T/A克隆 随后就可以利用质粒上插入基因两侧的酶切位点来克隆基因。 三、转（外源基因导入细胞） （一）转化方法 1、大肠杆菌的质粒转化 2、酵母的质粒转化方法 （二）转化率 （三）转化率的用途 （四）转化率的影响因素 1、大肠杆菌的质粒转化 （1）钙离子转化法 （2）电转化法 （3）大肠杆菌的?噬菌体转染 （1）钙离子转化法 适用于革兰氏阴性菌（如大肠杆菌），利用钙离子与细菌细胞膜磷脂在低温下形成液晶结构，这一状态下的细胞称为感受态细胞。此时细胞经过热脉冲发生收缩作用，细胞膜出现间隙，此时质粒DNA可通过进入细胞。 （2）电穿孔法 将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内。电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大。 （3）大肠杆菌的?噬菌体转染 2、 酵母的质粒转化方法 （1）乙酸锂转化法 （2）原生质体转化法 （3）电转化法 （二）转化率 转化率----单位质量的质粒转化大肠杆菌产生转化子的数量。 钙离子转化法：106--109/ug 超螺旋质粒 电转化法： 108--1010 /ug 超螺旋质粒 例如，pUC18对大肠杆菌的转化率为108，即每微克pUC18中只有108个分子能进入受体细胞。一微克pUC18共有3.4×1011个分子（6.02×1017 / 2686×660），即每3400个pUC18分子才有一个分子进入受体细胞 在实际操作过程中，转化一微