2011子0426-层析技术.pptVIP

层析技术 讲课内容 （1）吸附层析 定义 指混合物随流动相通过吸附剂时，由于吸附剂对不同物质的吸附力而使混合物分离的方法。 原理 在不同条件下，吸附剂与被吸附物之间的作用 物理作用的范德华吸附：无选择性，吸附速度快，吸附的过程是可逆的 化学吸附：由原子价力的作用引起。有选择性，吸附速度较慢，不易解吸 吸附层析 常用的吸附剂 （2）分配层析 ——利用不同组分在流动相和固定相中的分配系数不同而进行分离的方法。 固定相（凝胶） ——三维空间网状结构 ?三.凝胶层析的优点 1.凝胶是一种不带电荷的惰性载体，结构稳定。 2. 操作条件较温和。 3.样品得率高,重复性好,可进行大量样品的分离纯化。 四、凝胶层析的缺点 1.要求样品和洗脱液的粘度很低。 2.凝胶颗粒网络孔径大小非常有限,所以可被纯化的物质的分子量范围受到限制。 3.凝胶结构对某些溶质分子具有吸附作用。 层析柱的选择 层析柱大小：根据样品量的多少以及对分辨率的要求来进行选择 层析柱的长度对分辨率影响较大，长的层析柱分辨率要比短的高；但层析柱长度不能过长，否则会引起柱子不均一、流速过慢等实验上的一些困难 一般柱长度不超过100cm，为得到高分辨率，可以将柱子串联使用 层析柱的直径和长度比一般在1:25－1:100之间 用于分组分离的凝胶柱，如脱盐柱由于对分辨率要求较低，所以一般比较短 洗脱液的选择 凝胶层析的分离机理简单以及凝胶稳定工作的pH范围较广，所以洗脱液的选择主要取决于待分离样品，一般来说只要能溶解被洗脱物质并不使其变性的缓冲液都可以用于凝胶层析。 为了防止凝胶可能有吸附作用，一般洗脱液都含有一定浓度的盐。 2、加样 ※使液面和凝胶表面相切，关闭出口； ※加样时尽量不要破坏凝胶面； ※让样品进入凝胶以后在加蒸馏水开始洗脱。 (2)Ve = Vo + Vi Kd = 1 分子完全不被排阻 完全向凝胶颗粒内部扩散 在两相分配的比值为1,最后流出. (1)Ve = Vo Kd = 0 分子完全被排阻于凝胶颗粒之外 全部分布于流动相里, 最先流出。 (3) 0 Kd 1 Ve = Vo +ViKd 为溶质以某种程度向凝胶颗粒内扩散 Kd=0 0＜Kd1 Kd=1 洗脱体积 凝胶的种类和性质 凝胶种类 葡聚糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺和琼脂糖之间的交联物 多孔玻璃珠、多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶 （一）葡聚糖凝胶? 葡聚糖凝胶是指由天然高分子－葡聚糖与其它交联剂交联而成的凝胶。 基本骨架：葡聚糖（dextran） 交联剂：3-氯代-1 ,2-环氧氯丙 烷使葡聚糖之间通过醚键交联 聚合而成的三维空间网状结构。 Sephadex系列: 葡聚糖与3-氯-1,2环氧丙烷（交联剂）相互交联而成，交联度由环氧氯丙烷的百分比控制 Sephadex G-200，后面的数字是凝胶的吸水率（单位是ml / g干胶）乘以10 数字越大: 排阻极限越大，分离范围也越大 凝胶颗粒小的分离较好、分辨率较高，但流速低 凝胶颗粒大，流速高，但洗脱峰较为扁平，分辨率也较差 （二）琼脂糖凝胶 琼脂糖是从琼脂中分离出来的天然线性多糖，它是琼脂去掉其中带电荷的琼脂胶得到的 琼脂糖是由D－半乳糖和3,6－脱水半乳糖交替构成的多糖链 在100?C时呈液态，当温度降至40?C以下时，多糖链以氢键方式相互连接形成双链单环的琼脂糖，经凝聚即成为束状的琼脂糖凝胶 （三）、聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺交联而成。 聚丙烯酰胺凝胶主要由Bio-Rad生产 商品名：Bio-Gel P 型号： Bio-Gel P-2 P-300等10种 数字基本代表它们的排阻极限的103，数字越大，可分离的分子量也就越大 ■ 各 种 层 析 胶 体 ： Pharmacia Sephadex Sepharose Sephacryl Sephacel glucose agarose glucose + acrylamide cellulose Bio-Rad BioGel P BioGel A acrylamide agarose 凝胶的保存 反复洗涤去除蛋白等杂质 加入适当的抗菌剂（0.02％叠氮钠） 4?C下保存 较长时间的保存（凝胶洗涤后脱水、干燥） 将凝胶过滤抽干后浸泡在50％的乙醇中脱水 抽干后再逐步提高乙醇浓度反复浸泡脱水，至95％乙醇脱水后将凝胶抽干 置于60?C烘箱中烘干，即可装瓶保存 凝胶层析的基本操作 ■ 凝胶柱的装填方法： 装 填 胶 体 暂 停 流 洗 X 继 续 流 洗 已 堆 积 沉 淀 中 上 清 紧 密 堆 积 检 查 好 管 柱 是