姜黄素诱导人食发管癌ec-9706细胞凋亡及其机制的研究.docxVIP

河北医科大学 河北医科大学 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本学位论文在导师(或指导小组)的指导下，由本人独立完成。 本学位论文研究所获的研究成果，其知识产权归河北医科大学所有。 河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学 位论文主要内容相关的论文，第一署名单位为河北医科大学，试验材 料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。否则， 承担相应的法律责任。 研究生签名：赵蠹会导师 院领导签名： 月2富日 河北医科大学 研究生学位论文独创性声明 本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了 文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰 写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写， 文责自负。 研究生签名：赵耄冷导师签名 堙日 中文摘要姜黄素诱导人食管癌Ec．9706细胞凋亡 中文摘要 姜黄素诱导人食管癌Ec．9706细胞凋亡 及其机制的研究 摘 要 目的：食管癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，我国是食 管癌的高发国家，每年因食管癌死亡的人数占全部恶性肿瘤 死亡的近四分之一。目前治疗食管癌除早期手术，化学药物 已成为治疗恶性肿瘤的重要方法，但是绝大多数化学药物的 细胞毒作用缺乏特异性，在杀死肿瘤细胞的同时，无选择的 杀伤正常细胞。因此，寻找毒副作用小，抗瘤活性强的化疗 药物已成为国内外研究的热点。姜黄素是从姜黄属植物姜黄 的根茎中提取的一种植物多酚，可用于食品上色及佐味。近 年研究发现其药理作用广泛，如抗炎、抗氧化、抗凝、降血 脂、抗动脉硬化及抗肿瘤等作用。尤其姜黄素可诱导多种肿 瘤细胞凋亡，作为一种具有良好发展前景的抗癌药物，日益 引起人们的关注，但对人食管癌的作用及分子机制研究较 少，本研究通过体外培养人食管癌Ec．9706细胞，研究姜黄 素作用后细胞形态、细胞凋亡及其调控基因表达的影响，探 讨姜黄素在食管癌细胞中的作用机制，为食管癌的化学防治 提供实验依据。 肿瘤发生不仅是瘤细胞的过度增生，还存在死亡过少， 凋亡机制障碍，细胞凋亡参与肿瘤起始过程，并对肿瘤发生 发展起负调控作用。本研究运用多种实验技术，对细胞凋亡 中凋亡抑制蛋白因子(Livin)，促凋亡因子(Smac)矛1]Caspase．3 中文摘要进行检测和分析，以期进一步阐明细胞凋亡调控基因在肿瘤 中文摘要 进行检测和分析，以期进一步阐明细胞凋亡调控基因在肿瘤 发生发展中的作用。 方法：将Ec．9706细胞于37℃，饱和湿度5％C02的常 规条件下培养，待细胞进入对数生长期后用于实验。 l应用光镜观察细胞形态学变化：将不同浓度的姜黄素 作用于Ec．9706细胞，在倒置相差显微镜下定时观察细胞的 生长情况并照相。 2采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测药物对细胞的生长 抑制作用。 3流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡、细胞周期分布：收集 经不同浓度姜黄素作用12h、24h、48h的Ec．9706细胞及对 照组细胞，冷PBS漂洗。预冷70％乙醇4C，固定，上机检 测前离心去固定液，O．5％胃蛋白酶消化，碘化丙锭(Propidium Iodide，PI：50mg／L Trinton X-100 1．O％)室温避光染色。流式 细胞仪上机检测，应用软件进行分析。 4 FCM检测caspase．3蛋白的表达：收集经不同浓度姜黄 素作用12h、24h、48h的Ec．9706细胞及对照组细胞，按常 规方法进行荧光标记，流式细胞仪检测荧光强度，以荧光指 数(FI)表示蛋白的表达情况。 5应用免疫细胞化学方法观察细胞凋亡调控因子Srnac、 Caspase3蛋白表达的变化。 6 western blot半定量检测基因蛋白Livin、Smac、Caspase3 表达，并分析各蛋白表达之间的相关性及其在姜黄素抗食管 癌中的作用机制。 结果： 中文摘要姜黄素对Ec．9706细胞凋亡及其调控基因的影响 中文摘要 姜黄素对Ec．9706细胞凋亡及其调控基因的影响 1经40、80、120、160}tmol／ml姜黄素处理Ec．9706细 胞12h、24h和48h后，倒置相差显微镜下观察，与对照组相 比，用药组的细胞生长明显被抑制，胞浆内颗粒增多增粗， 核浆比例降低，部分细胞变圆而悬浮在培养基内。提示 Ec．9706细胞趋于凋亡。 2分别用姜黄素(O、40、80、120、160Iamol／m1)作用于 Ec．9706细胞12、24、48h，MTT结果显示姜黄素能明显抑 制Ec．9706细胞的增殖，并呈剂量和时间依赖性。作用12h、 24h和48h后，Ec．9706细胞半数抑制率(inhibitory concentration giving 5 0％inhibition， IC50)分别为 2 16．1447p