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第九章 基因诊断 第一节 基因诊断的概念 及常用技术 基因诊断—利用分子生物学技术，从 DNA/RNA水平检测基因的存在,分析基因的结构变异和表达状态，从而对疾病作出诊断。 二、基因诊断常用方法 ㈠ 核酸分子杂交 ㈡ PCR ㈢ DNA序列测定 ㈣ DNA芯片技术 (一) 核酸杂交 基本原理-------核酸变性和复性理论 即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链解开，而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双链结构。因此应用已知碱基序列的单链核苷酸片段作为探针，就可检测样本中是否存在与其互补的同源核苷酸序列。 核酸杂交的关键要素 probe DNA target DNA signal detection 核酸杂交方法分类 按作用环境大致分为固相杂交和液相杂交两种类型。 固相杂交是将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上，一条反应核酸游离在溶液中。 液相杂交所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。 固相杂交分类 Southern 印记杂交 Northern 印记杂交 斑点杂交 原位杂交 Northern杂交 用于RNA的检测，能对组织细胞中总RNA或mRNA进行定性和定量分析。 斑点杂交（Dot blot） 可用基因组中特定基因及其表达的定性及定量分析，方法简单、快速灵敏、样品用量少；其缺点是不能鉴定所测基因的分子量，特异性不高，有一定比例的假阳性。 原位杂交（Colony in situ hybridization） 可查明染色体中特定基因的位置，用于染色体疾病的诊断；原位杂交的结果是显示有关核酸序列的空间位置情况，因此可检出含核酸序列的具体细胞，细胞的具体定位，数目和类型，可检出基因和基因产物的亚细胞定位。 （二）利用PCR及结合其他技术进行基因诊断 直接采用PCR进行基因诊断 采用PCR产物的限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLPs）进行基因诊断 采用PCR结合等位基因特异性寡核苷酸探针（ASO）斑点杂交进行基因诊断 * 通过PCR产物的反相点杂交(RBD)进行基因诊断 采用PCR产物的单链构象多态性(SSCP)分析进行基因诊断 采用PCR技术对靶核酸进行定量分析 （三） DNA序列测定 DNA序列测定是进行基因突变检测的最直接、最准确的方法，可以确定突变的部位，突变的性质。 （四 ） DNA芯片技术 应用DNA芯片，可以检测基因的结构及其突变多态性，对基因表达的情况进行分析。 二 基因诊断的特点 高特异性 高灵敏度 获得稳定的结果 早期快速 适用性强，应用范围广 第二节 遗传病的基因诊断 一、概述 人类的遗传病达数千种 地中海贫血在意大利等国家发病率达10％ 镰状细胞贫血在美国黑人中发病率达14％ 我国常见的遗传性疾病有地中海贫血、异常血红蛋白病和血友病。 有效治疗难；通过基因诊断进行携带者筛查，产前早期诊断，降低发病率。 二、镰状细胞贫血 血红蛋白病（异常血红蛋白病） 红细胞呈镰刀状，寿命短，引起溶血性贫血。 患者多在成年以前死亡 （二）镰状细胞贫血的基因诊断方法 限制性内切酶/Southern blot 采集制备血液DNA→内切酶MstⅡ消化→电泳→转膜→32P标记的β珠蛋白cDNA杂交→放射自显影 PCR/限制性内切酶 设计引物→PCR扩增→产物进行限制性内切酶酶切→电泳→EB染色→直接观察 例： 引物1：5’-GGG CTG GGC ATA AAA GTCA-3’ 引物2：5’-AAT AGA CCA ATA GGC AGAG-3’ 扩增产物294bp 镰状细胞贫血的基因诊断方法 RT-PCR/序列分析 采集制备血液RNA→RT-PCR→产物测序→推测氨基酸序列→进行诊断 二、β－地中海贫血(β－Thalassaemia,简写βthal或βT) β珠蛋白基因突变导致该多肽链的合成大为减少（β＋）或完全缺失（β0） β珠蛋白合成速率降低，导致β链和α链合成的不平衡→多余的珠蛋白链沉积在红细胞膜上→改变了膜的通透性和硬度→导致溶血性贫血。 高危人群地中海人、中东人、印度人、中国人；中国人群中又一广东、广西、四川、贵州等省发病率最高。 缺乏有效治疗措施。 （一） β地贫病的分子基础 β珠蛋白基因全长2053bp，含2个内含子（IVS－I和IVS-II），3个外显子。 目前发现突变有百余种，中国人群发现约20种； 一般对特定种族来说，90%的β地贫基因仅由4～6种突变组成。 （二） β地中海贫血的基因诊断 PCR/ASO斑点杂交法 合成2对PCR引物（扩增区段700bp和580bp，分别包含14种和1种可能突变）→合成等位特异寡核苷酸(ASO)探针（4～6对，分别标记） →制备DNA样品 →PCR扩增 →斑点印迹杂交 RFLP分析