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Thank you Gene engineering * * 第二章 基因克隆所需的工具酶 一、限制性内切酶(restriction enzyme) 1．限制性核酸内切酶的发现 限制性核酸内切酶，是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。它们主要是从原核生物中分离纯化出来的。 根据1994年美国出版的《分子生物学百科全书》的统计数字，仅Ⅱ型核酸内切限制酶一项迄今就已从各种不同的微生物当中，分离出了2300种以上，可识别230种不同的DNA序列。 早在本世纪中期，以Arber等人对入噬菌体在大肠杆菌不同菌株上的平板培养效应的研究为基础，发现了原核生物体内存在着寄生控制的限制(restriction)和修饰(modification)系统。 在限制修饰系统中限制作用是指一定类型的细菌可以通过限制性酶的作用，破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制； 而生物细胞(如宿主)自身的DNA分子合成后，通过修饰酶的作用：在碱基中特定的位置上发生了甲基化而得到了修饰，可免遭自身限制性酶的破坏，这就是限制修饰系统中修饰作用的含义。 2．核酸内切限制酶的类型 特性 I型 II型 III型 限制和修饰活性 单一多功能的酶 分开的核酸内切酶和甲基化酶 具有一种共同亚基的双功能的酶 核酸内切限制酶的蛋白质结构 3种不同的亚基 单一的成份 2种不同的亚基 切割位点 在距寄主特异性位点至少1000bp的地方可能随机地切割 位于寄主特异性位点或其附近 ? 距寄主特异性位点3，端24~26bp处 甲基化作用的位点 寄主特异性的位点 寄主特异性的位点 寄主特异性的位点 识别未甲基化的序列进行核酸内切酶切割 能 能 能 序列特异的切割 不是 是 是 DNA克隆中的用处 无用 十分有用 用处不大 3．核酸内切限制酶的命名法 由于发现了大量的限制酶，所以需要有一个统一的命名法。H．O．Smith和D．Nathans(1973)提议的命名系统，已被广大学者所接受。他们建议的命名原则包括如下几点： （1） 用属名的头一个字母和种名的头两个字母，组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名称。例如，大肠杆菌(Escherichia coli)用Eco表示，流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)用Hin表示。 （2） 用一个写在右下方的标注字母代表菌株或型，例如Ecok。 （3）如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制与修饰体系，则以罗马数字表示。因此，流感嗜血菌Rd菌株的几个限制与修饰体系分别表示为HindI、HindII、HindIII等等。 （4）所有的限制酶，除了总的名称核酸内切限制酶R外，还带有系统的名称，例如核酸内切酶R．HindIII。同样地，修饰酶则在它的系统名称之前加上甲基化酶M的名称。相应于核酸内切酶R．HindIII的流感嗜血菌Rd菌株的修饰酶，命名为甲基化酶M. HindIII。 在实际应用上，这个命名体系已经作了进一步的简化： ①由于附有标注字母在印刷上很不方便，所以现在通行的是把全部略语字母写成一行。 ②在上下文已经交待得十分清楚只涉及限制酶的地方，核酸内切酶的名称R便被省去。 4.Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性 它具有三个基本特性： a. 在DNA分子双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子产生链的断裂； b. 2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的； c.??? 因此，断裂的结果形成的DNA片段，也往往具有互补的单链延伸末端。 a. 识别位点： 绝大多数的II型核酸内切限制酶，都能够识别由4～8个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。我们称这样的序列为核酸内切限制酶的识别序列。 切割位点的一个共同特点是，它们具有双重旋转对称的结构形式，换言之，这些核苷酸对的顺序是呈回文结构，例如： 5-CTGCA G-3, 5-CTGCA G-3, （a）Pst I切割位点 , 切割后形成3`—OH的单链粘性末端， 3-G ACGT