组织培养千实验指导书.docVIP

PAGE PAGE 1 实验一 组培器皿及器械的洗涤、灭菌及环境的消毒 一、实验目的 通过实验，使学生了解并掌握组织培养用实验器皿及器械的洗涤、灭菌，环境的消毒方法。 二、实验原理 实验仪器及器械的清洗、消毒和灭菌是组织培养成功的关键所在，是外植体免受污染的前提。由于灭菌剂的种类不同，所以选择消毒剂既要考虑良好的消毒、杀菌作用，同时易被蒸馏水冲洗掉。 无菌的环境是植物组织培养成功的前提，因为绝大多数操作程序要求在无菌条件下进行。 三、实验操作步骤 （一）器皿与用具的洗涤 1、玻璃器皿的洗涤 新购置的玻璃器皿或多或少都含有游离的碱性物质。使用前要先用1%稀HCL浸泡一夜，再用肥皂水洗净，清水冲洗后，再用蒸馏水冲洗1次，晾干后备用。用过的玻璃器皿，用清水冲洗，蒸馏水冲洗一次，干后备用即可。 对于已被污染的玻璃器皿则必须在高压蒸汽灭菌后，倒去残渣，用毛刷刷去瓶壁上的培养液和病斑后，再用清水冲洗干净，蒸馏水冲淋一遍，晾干备用，切忌不可用水直接冲洗，否则会造成培养环境的污染。清洗后的玻璃器皿，瓶壁应透明发亮，内外壁水膜均一，不挂水珠。 2、金属用具的洗涤 新购置的金属用具表面上有一层油腻，需擦净油腻后再用热肥皂水洗净，清水冲洗后，擦干备用。用过的金属用具，用清水洗净，擦干备用即可。 3、每人清洗部分玻璃器皿 清水洗净→浸入洗衣粉溶液中洗刷→清水反复冲洗→蒸馏水淋一遍→烘干备用。 对于较脏玻璃器皿的洗涤：采用先碱后酸的方法，即用洗衣粉洗刷后冲洗干净→晾干→浸入酪酸洗液（一种强氧化剂，去污能力强，配制方法：重铬酸钾40克，溶解在500ml在水中，然后徐徐加入450ml粗制浓硫酸），浸泡时间视器皿的肮脏程度而定→清水反复冲洗干净→蒸馏水淋洗一遍→烘干备用。 对于带有石蜡或胶布的器皿：先将其除去，再用常规洗涤，石蜡用水煮沸数次即可去掉，胶布粘着物则需用洗衣粉液煮沸数小时，再用水冲洗，凉干后浸入洗液，以后的步骤同前。 （二）玻璃器皿、用具及环境的灭菌 1、玻璃器皿和用具的灭菌 （1）采用干热灭菌法： 将洗干净晾干后的培养皿、三角瓶、吸管等玻璃用具和解剖针、解剖刀、镊子等金属器具，用纸包好，放进电热烘干箱，当温度升至100℃时，启动箱内鼓风机，使电热箱内的温度均匀。当温度升至150℃时，定时控制40min（或 （2）采用高压蒸汽灭菌法： 即用手提式高压灭菌锅，在1.2个大气压下保持15～20分钟。有些如聚丙烯、聚甲基戊烯等类型的塑料用具也可以进行高温消毒。 （3）灼烧灭菌： 用于无菌操作的镊子、解剖刀等用具除高压蒸汽灭菌外，在接种过程中还常常采用灼烧灭菌，将镊子、解剖刀等从浸入95%酒精中取出，置于酒精灯火焰上灼烧，借助酒精瞬间燃烧产生高热来达到杀菌等目的。操作过程中要反复浸泡、灼烧、放凉、使用，操作完毕后，用具应擦拭干净后再放置。 2、环境的消毒 （1）地面、墙壁和工作台的灭菌 每次使用前，将配好的20%新洁尔灭（苯扎溴铵）溶液倒入喷雾器中，对接种室地面、墙壁、角落均匀地喷雾。在喷房顶时间，注意不要让药液滴入眼睛。然后开启紫外灯开关，照射15～30min，一般紫外线消毒后不要立即进入，应在关闭紫外灯15-20min后进入室内。 （2）无菌室和培养室的灭菌 消毒灭菌的方法：首先将房子关闭，定期用甲醛和高锰酸钾2：1的比例定期熏蒸灭菌24h或用70%的酒精或0.5%苯酚喷雾降尘和消毒。操作时要戴好口罩和手套，用甲醛与高锰酸钾配比时要注意避开烟雾，封闭消毒期间不宜进入消毒空间。 三、 实验报告 1．将本次实验内容整理成实验报告。 2. 试阐述为什么要对器皿和用具进行严格的洗涤和灭菌？ 实验二 培养基母液的配制与保存（MS培养基） 一、实验目的 通过学习MS培养基母液的配制与保存，掌握培养基母液浓度的换算、配制与母液的保存方法。 二、实验原理 培养基制备之前，为了使用方便和用量准确，常常将大量元素、微量元素、铁盐、有机物类、激素类分别配制成比培养基配方需要量大若干倍的母液。当制备培养基时，只需要按预先计算好的量吸取母液即可。 三、实验仪器、用具及试剂 （一） 实验仪器、器皿及用具 电子天平（感量为0.0001g、0.01g）,烧杯（1000ml，100ml，50ml）、量筒（1000ml，100ml，50ml）、容量瓶（1000ml，500ml，200 ml，100ml，50ml）、棕色或白色广口瓶（1000ml，500ml，200 ml，100ml）、药匙、玻璃棒、称量纸、标签、冰箱。 （二）试剂 MS培养基所需各种试剂、IAA、IBA、NAA、6-BA、2,4-D、GA3、KT、蒸馏水、重蒸馏水。 四、实验步骤与方法 母液的配制是按所使用药品的类别，而分别配成大量元素、微量元素、维生素、钙盐、镁盐和铁盐等。配制母液时特别要注意无机盐成分