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植物基因工程 植物转基因的主要方法 农杆菌介导的基因转移 以原生质体或细胞（组织）作为受体的直接基因转移，如： 聚乙二醇法（PEG） 电击（EP ，electroporation） 脂质体（Lip， Lome） 磷酸钙－DNA共沉淀（Ca－P） 微注射（Mi ，Microinjection） 基因枪法（particle bombardment，简称PB） 超声波法（Ulstrasonication） 种质系统（germ line transtormation）的基因转移，如利用子房注射 、种胚以及花粉管通道等导入外源基因 植物基因工程 1.根癌农杆菌与植物转化的分子生物学 2.植物基因工程中Ti载体及其构建 3.植物基因转化受体系统 4.根癌农杆菌转化程序 5.植物病毒介导的基因转化 1.根癌农杆菌与植物转化的分子生物学 1.1 植物冠瘿瘤－植物的一种癌症 1.2 Ti质粒 1.3 T－DNA 1.4 Vir区的基因结构与功能 1.5 农杆菌Ti质粒基因转化机理 1.1植物冠瘿瘤——植物的一种癌症 1.1冠瘿瘤 植物与人一样，可以产生各种各样的瘤和癌。其中一类瘤被叫作瘿，瘿的种类很多。引起瘿的因素有：受伤、昆虫、病毒、细菌和特定的基因组织表达等。人们最感兴趣的瘿是冠瘿瘤。 1.1.1冠瘿瘤的起因 由根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）[属根瘤菌科（Rhizobiaceat）]对植物的侵染而引起。 1.1.2冠瘿瘤的侵染过程 细菌通过伤口进入植物，在基因水平上转化植物。细菌DNA中的编码基因在植物细胞中表达，刺激植物细胞不受控制的分裂，形成瘤。 冠瘿瘤 1.1.3 冠瘿瘤的一般生物学特性 45℃杀死侵染植物的根癌农杆菌，植物组织仍然能形成癌。把瘤组织培养在不加生长素和细胞分裂素的培养基上，能够无限止的分裂和生长。 （1）根癌农杆菌转化植物细胞的能力是因为它含有一个叫作Ti（tumor-inducing）的质粒（Ti plasmid）。 （2）根癌农杆菌侵染植物后产生两种物质：类植物激素和冠瘿碱。类植物激素使细胞大量扩增，出现冠瘿瘤；冠瘿碱是受侵染植物组织合成的稀有氨基酸，包括胭脂碱、章鱼碱等。冠瘿碱是根癌农杆菌生活的C、N和能量来源。 1.2 Ti质粒 1.2.1 Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双股共价闭合环状DNA分子，其分子量为95～156× 106D，约有200kb。最近有人发现农杆菌中还有其它的质粒，称之为隐秘质粒。稳秘质粒的功能还不清楚，有的认为可能是缺陷型的Ti质粒。迄今已从多种植物中分离出不同种类的根癌农杆菌。 1.2 Ti质粒 1.2.2 Ti质粒的物理图谱 物理图谱：限制性内切酶酶切片段在Ti-DNA上的排列顺序。 Ti物理图谱构建：经限制性内切酶处理之后的Ti质粒DNA，用琼脂糖凝胶电泳作片段分离，便可显示出有20多条大小不同的DNA酶切片段。然后将这些酶切片段进行分子杂交分析，测定顺序，再排列成完整的物理图。 1.2 Ti质粒 1.2.3 Ti质粒的基因图谱 基因图谱：基因在Ti-DNA上的排列顺序。 基因图谱构建：转座子标签法 利用细菌的转座子（transposon），使Ti质粒发生嵌入突变和缺失突变。细菌转座子带有各种抗菌素抗性的基因，在转化过程中它们可嵌入Ti质粒，使根癌农杆菌带有相应的抗菌素抗性，因而可方便地筛选出转座子嵌入Ti质粒突变体。由于在转座子嵌入处的编码基因发生失活，因而可通过分析Ti质粒限制性内切酶片段的变化，如某些片段消失或电泳迁移率改变，确定这些基因插入位置，并且与突变体的表型相对应，从而建立Ti质粒的基因图。 目前已建立了十多个Ti质粒的基因图，其中主要是章鱼碱型和胭脂碱型两大类的Ti质粒基因图。 1.2 Ti质粒 Ti质粒的基因图谱 不同的Ti质粒有二个同源区： ①Vir区（转化所必须） 是毒性区，也叫毒性基因或Vir基因或致病基因。 ②T－DNA（transforming DNA） T－DNA是Ti质粒的转化植物的DNA，故称T－DNA。在转化植物细胞二倍体基因组中含有一个或几个（至多）T－DNA拷贝。noc是编码细菌利用胭脂碱的基因。 1.2 Ti质粒 1.2.4 Ti质粒的基因位点及其功能区域 （1）T－DNA区（transferred-DNA regions）： T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA，故称之为转移DNA。该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。 （2）Vir区（virulence region）： 该区段上的基因能激活T-