蛋白质分离技术好-层析2.pptVIP

亲 和 层 析Affinity Chromatography（AC）?;一、原理;酶： 基质类似物，抑制剂，辅酶 抗体： 抗原，病毒，细胞 DNA： 互补DNA或RNA，组蛋白，核酸聚合酶， 结合 蛋白 激素或药物：受体，载体蛋白 细胞： 细胞表面特异蛋白，外源凝集素 凝集素： 多糖，糖蛋白，细胞表面受体，细胞 ;Some definitions in affinity chromatography;;固相化——将配体以共价键连接于载体上制成亲和吸附剂;二、亲和层析分离过程;; ;（2）特异性洗脱法： 一种是选择与配体有亲和力的物质进行洗脱： 竞争对配体的结合，这种物质与配体的亲和力强或浓度较大，配体就会基本被这种物质占据，待分离物质被取代并洗脱。 例如：用单糖洗脱与凝集素结合的糖蛋白 另一种是选择与待分离物质有亲和力的物质进行洗脱：; 已使用过和柱，经过再生处理，去除非特异吸附的杂质后，可重复使用。 再生步骤： 起始缓冲液重复平衡一次 用高离子强度和低离子强度溶液处理 用弱酸或弱碱溶液处理;三 载体（基质）的选择;2、常用载体 一般纤维素以及交联葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺、多孔玻璃珠等用于凝胶排阻层析的凝胶都可以作为亲和层析的基质，其中以琼脂糖凝胶应用最为广泛。 （1）纤维素 优点：来源丰富，可供偶联基团较多，偶联后基团又能突出在载体外 缺点：结构不均匀，使偶联上配基浓度不一， 非专一性吸附严重 用于抗体和酶的纯化;（2）葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺 优点： 化学及物理性质稳定，可用强碱除去非特异吸附杂质。 缺点：孔径相对比较小，而且孔径的稳定性不好，可能会在与配体偶联时有较大的降低。; （4）琼脂糖凝胶 非特异性吸附低、稳定性好、孔径均匀适当、宜于活化等优点，因此得到了广泛的应用。 商品名：Sepharose 型号：2B，4B，6B 型号含义：琼脂糖浓度为2%，4%，6% 因为Sepharose 4B的结构比6B疏松，而吸附容量比2B大，所以4B应用最广。 ;四 配基的选择;;三、亲和层析的优缺点;;四、应用;Ixv_2 JB 980910;一、原理;;;;二、离子交换剂的类型;阳离子交换基;阴离子交换基;;离子交换树脂 离子交换纤维素 离子交换凝胶 ;1.离子交换树脂： 聚苯乙烯树脂：;离子交换树脂的性质;Dowex 100 149?m Dowex 50 297?m Dowex 20 840?m;阳离子交换树脂 强酸型 磺酸基 -SO3-H+ 中等酸型 磷酸根 -O-PO2H2 亚磷酸根 -O-POH2 弱酸型 羧基 -COOH 阴离子交换树脂 强碱 季胺基团 [-N+(CH3)3] 弱碱 叔胺、仲胺、伯胺基团 ;离子交换树脂对离子的亲和力;①阳离子树脂 电价数：Na+Ca++Al+++Ti++++ 原子价数相同，原子序数 Li+Na+K+Pb+ ②阴离子 强碱性交换树脂 CH3COO-F-OH-HCOO-CL-SCN-Br-CrO4=NO3-I-C2O4=SO4= 弱碱性交换树脂 F- CL- Br-= I- =CH3COOMo4=PO4=NO3-酒石酸根柠檬酸根C2O4=SO4=OH;操作过程： 1.装柱； 2.离子交换； 3.洗脱;三、离子交换剂与缓冲液的选择 ;阴、阳离子交换剂的选择;离子交换剂的选择图;不同离子型交换剂的选择;不同基质离子交换剂的选择;1、缓冲液pH的选择 2、缓冲液离子组成的选择 3、缓冲液离子强度的选择 ;1、缓冲液pH的选择 ;2、缓冲液离子组成的选择;3、缓冲液离子强度的选择; 原则： 所用洗脱液比吸着物质具有更活泼的离子或基团 改变pH或离子强度 增强洗脱液与离子交换剂的结合力 降低分离物与离子交换剂的结合力 洗脱方式：梯度洗脱;四、应用;五、离子