外源基止因的表达08.pptVIP

外源基因表达系统由基因表达载体和相应的受体细胞两部分组成。 基因表达系统有原核生物基因表达系统和真核生物基因表达系统。 （1）大多数为单细胞异养，生长快，代谢易于控制，可通过发酵迅速获得大量基因表达产物。 （2）基因组结构简单，便于基因操作和分析。 （3）多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体，便于构建相应的表达载体。 （4）生理代谢途径及基因表达调控机制比较清楚。 （5）不具备真核生物的蛋白质加工系统，表达产物无特定的空间构象。 （6）内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造成表达产物的不稳定性。 　　外源基因在受体细胞中的表达包括转录和翻译两个环节，它是在一系列酶蛋白和调控序列的共同作用下完成的。 一、启动子 启动子(promoter, P)是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。 （1）转录起始位点: 大多数细菌启动子转录起始区的序列为CAT，转录从第二个碱基开始，该碱基为嘌呤碱基（A/G）。 （2）Pribnow框: 在距转录起始位点上游存在一个6bp保守序列：TATAAT，由于富含A、T，又称为TATA box，中间的碱基位于转录起始点上游的10bp处，又称为 –10序列区。少数Pribnow框中间碱基的位置在 –9～-18之间变化。 （3）Sextama框: 在转录启动区的另一个六联体保守序列位于距转录起始位点上游35bp处，通常称为-35区，该保守序列为TTGACA，其中前三个碱基具有较强的保守性，它是RNA聚合酶的识别位点。 　 （4）间隔区: 原核生物启动子在转录起始位点与Pribnow框之间、Pribnow框与Sextama框之间存在长度不等的间隔序列。间隔序列内部无明显的保守性，其序列的碱基组成对启动子的功能并不十分重要, 但间隔序列的长度却是影响启动子功能的重要因素。 启动子强弱取决于-35区和-10区的碱基组成及其间隔序列 原核RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子。 原核表达系统中通常使用可调控的强启动子有Lac、Trp、?PL、Tac等。 　根据真核基因编码的产物和RNA聚合酶的种类可把真核生物的启动子分为三类： Ⅰ型启动子: rRNA基因启动子。 Ⅱ型启动子: mRNA基因启动子。 Ⅲ型启动子: tRNA启动子。 所属的基因绝大多数为编码蛋白质。 Ⅱ型启动子也具有两个高度保守的共有序列。其一是在－25附近的一段AT富集序列，其共有序列是TATAA，称为TATA盒。TATA盒与原核的Pribonow盒相似，是与DNA双链的解链有关，决定转录的起始。其二是在多数启动子中，-70附近共有序列CAAT区，称为CAAT盒，与RNA酶的结合有关。除以上两个区域外，有些启动子上游中含有GC盒，是转录因子与DNA分子此它们可影响转录起始的频率。启动子决定了被转录基因的启动频率与精确性，同时启动子在DNA序列中的位置和方向是严格固定的，是由5′到3′方向。 　 　 转录终止过程包括： 　 （1）RNA聚合酶停在DNA模板上不再前进， RNA的延伸也停止在终止信号上； 　 （2）完成转录的RNA从RNA聚合酶上释放出来； （3）RNA聚合酶从模板上释放出来。 mRNA的翻译起始效率主要由其5’端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS），它包括下列四个特征要素： （1）位于翻译起始密码子上游的6至8个核苷酸序列5’UAAGGAGG3’，即Shine-Dalgarno(SD)序列，富含嘌呤核苷酸，通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16S rRNA 3’端的富含嘧啶区域3’AUUCCUCC5’并与之专一性结合，将RNA定位于核糖体上，从而启动翻译。 　 （2）翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架的起始位点，但有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子 。 　（3）SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成。 　（4）基因编码区5’端若干密码子的碱基序列。 　 在组成蛋白质的20种氨基酸中，只有甲硫氨酸和色氨酸仅对应唯一的密码子，另外18种氨基酸均拥有2至6种不同的密码子，这些编码相同氨基酸的不同密码子称为简并密码子。 在E. coli中，并非每一种密码子都拥有自己的tRNA，同一种tRNA分子往往可以识别多种简并密码子。 　 采用外源基因全合成的方法，按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律，设计更换外源基因中不适宜的相应简并密码子。 　 　 增强子（enhan