KAPA文库定量试剂盒说明书1.产品说明.PDFVIP

KAPA 文库定量试剂盒说明书 1. 产品说明： 文库精确的定量对于二代测序的结果是非常重要的，过低估计文库的大小，导致clusters 或多重模板太多，数据质量不高，过高估计文库的大小，导致数据读取量少，基因组覆盖率 低，所以低估或者高估文库的量都会影响测序效果。qPCR 是DNA 文库定量的金标准，也 是唯一一种能够准确检测出分子数目的方法。 KAPA 文库定量试剂盒包含6 个10 倍稀释的DNA 标准品，10×Primer Premix，搭配有 KAPA SYBR FAST qPCR 试剂盒，十分准确的确定文库的分子数目。DNA 标准品片段长度 为452bp ，两端包含定量引物的结合位点。通过标准曲线计算得到定量结果。 基于qPCR 方法的文库定量主要取决于三个因素：① 准确、重现性非常好的标准品的 使用；② 用于qPCR 的DNA 聚合酶有较高的扩增效率，且扩增效率均衡；③重复性好。 KAPA SYBR FAST qPCR 试剂盒具有高性能、高通量、实时定量PCR 等特点。该试剂盒包 含一种基因工程酶，耐受SYBR Green Ⅰ染料的抑制作用，KAPA SYBR FAST qPCR 试剂盒 是文库定量的理想产品，该试剂盒也适用于扩增高AT 、GC 以及1kb 以上的片段。 2. 应用： KAPA Illumina GA 文库定量试剂盒是用于文库定量的理想产品：  定量引物序列： Primer P1: 5’-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GA-3’ Primer P2: 5’-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA-3’  浓度范围广；  包含高GC 含量的片段；  扩增片段长度：50~1000bp。 3. 操作流程： 1) 将 1ml Primer Premix 与5ml 的KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix （2× ）充分混合； 2) 制备好的DNA 文库稀释3 个梯度，即：1:2000、1:4000、1:8000； 3) qPCR 反应体系： 试剂 加入量 引物与KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix 的混合物 12μl ddH2O 4μl 稀释的DNA 文库及标准品（1~6） 4μl 总体积 20μl *也适用于10μl体系，引物与KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix 的混合物加6μl，模板加4μl。 4) qPCR 反应程序： 程序 温度 时间 预变性 95℃ 5min 变性 95℃ 30s 35cycles 退火/延伸 60℃ 45s 1 * 熔解曲线分析是可选的，但在某些情况下，熔解曲线可以反应文库是否有非特异扩增及引物二 聚体的污染；2KAPA SYBR® FAST qPCR试剂扩增速度快，较长的退火延伸时间能够增加文库的 覆盖范围，当片段长度在700bp 以上时，建议退火延伸时间为90s 。 5) 分析数据：确认标准品及文库扩增效率在90~110%； 6) 计算文库浓度：采用绝对定量方法，通过452bp 的DNA 标准品计算出文库的浓度 4. 详细说明： 注意事项：  在qPCR 反应前，将1ml Primer Premix 与5ml 的KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix （2× ）混合，漩涡震荡10s；  建议反应体系为20 μl ；  确认所有试剂充分溶解并混匀后待用；