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DUCK179制作 基因工程的基本操作程序(四个步骤) 基因工程的基本操作程序 目的基因的获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 操作过程 目的基因的检测与鉴定 一、目的基因的获取 获取目的基因是实施基因工程的第一步。 目的基因主要是指______________________ 获取目的基因的常用方法 ①从基因文库中获取 （基因组文库，部分基因文库） ②利用PCR技术扩增目的基因 （变性，复性或退火，延伸） ③通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成 编码蛋白质的结构基因 基因文库 基因组文库（全部） 部分基因文库（如:cDNA文库） 1.基因文库 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库 （一）从基因文库中获得目的基因 ① 概念：PCR全称为_______________，是一项 在生物____复制_____________的核酸合成技术 ③条件：_______________________________、 _______________、___________ (做启动子)、 ___________ ②原理：__________ ④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循 环的次数） ⑤结果： 聚合酶链式反应 体外 特定DNA片段 DNA复制 一段已知目的基因的核苷酸序列 四种脱氧核苷酸 一对引物 DNA聚合酶(热稳定DNA聚合酶即Taq酶） 指数 2n 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增 （二）利用PCR技术扩增目的基因 IMN 6 过程： 变性、退火、延伸三步曲 变性 退火 延伸 （二）利用PCR技术扩增目的基因 IMN (三). 通过DNA合成仪用化学的方法直接人工合成 基因_____，核苷酸序列______ 。 较小 已知 1.用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。 2.用_____________切断目的基因，使其产生_________________。 3.将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量_____________，形成了一个重组DNA分子（重组质粒） 限制酶 黏性末端 同一种限制酶 切口 DNA连接酶 相同的黏性末端 二、基因表达载体的构建 质粒 目的基因 限制酶 DNA连接酶 重组DNA 基因表达载体的构建 质粒 DNA分子 限制酶处理 一个切口 两个黏性末端 两个切口 获得目的基因 DNA连接酶 重组DNA分子（重组质粒） 同一种 4.过程: 二、基因表达载体的构建 5.基因表达载体的组成： 复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因 二、基因表达载体的构建 基因表达载体的组成： 目的基因、启动子、终止子、标记基因 启动子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端， 是RNA聚合酶识别和结合的部位。 终止子：位于基因的尾端，也是一段有特殊结构的DNA 片段，使转录在所需要的地方停止下来。 标记基因：为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因， 从而将含有目的基因的细胞筛选出来。 二、基因表达载体的构建 转化 —— 方法 将目的基因导入 植物细胞 将目的基因导入 动物细胞 将目的基因导入 微生物细胞 农杆菌转化法 基因枪法（双） 花粉管通道法 ——显微注射法 ——Ca2+感受态细胞 目的基因进入_________内，并且在 受体细胞内维持_____和_____的过程 受体细胞 稳定 表达 三、将目的基因导入受体细胞 1、将目的基因导入植物细胞的方法： 三、将目的基因导入受体细胞 农杆菌转化法（双、裸） 2、将目的基因导入动物细胞 （1）方法： （2）程序注射过程_.flv 3、将目的基因导入微生物细胞 （1）常用大肠杆菌： 繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少 （2）大肠杆菌的转化方法 首先用Ca2+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。第二步是将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。 三、将目的基因导入受体细胞 显微注射法 检测 鉴定： ①检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因 ②检测目的基因是否转录出了mRNA ③检测目的基因是否翻译成蛋白质 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 方法—— 方法—— 方法—— DNA分子杂交 分子杂交 抗原抗体杂交 四、目的基因的检测与鉴定 DNA分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成