基因工程化基本操作的四个步骤.pptVIP

(一)从基因文库中获取目的基因 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库 * * 基因工程基本操作的四个步骤 1、目的基因的获取 2、基因表达载体的构建 3、将目的基因导入受体细胞 4、目的基因的检测与鉴定 一、目的基因的获取 1、目的基因主要是指______________________ 编码蛋白质的结构基因 2、获取目的基因的常用方法有哪些? （1）从基因文库中获取 （2）利用PCR技术扩增 （3）人工合成 请阅读P9第一和二两段 基因文库 基因组文库（某物种全部基因 ） 部分基因文库 （如:cDNA文库） 1.基因文库 2.基因文库的构建方法与目的基因的获得 ①鸟枪法： 供体细胞中的DNA 许多DNA片段 运载体 限制酶 与载体连接载入 受体细胞 （基因组文库） 产生特定性状 导入 外源DNA扩增 目的基因 分离 (直接分离法) (一)从基因文库中获取目的基因 ②反转录法： 以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。 目的基因的mRNA 杂交双链 (单链RNA/单链DNA) 单链DNA 反转录酶 核酸酶H 2.基因文库的构建方法与目的基因的获得 DNA聚合酶 双链DNA(目的基因) （cDNA文库） ③根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ： 根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。 蛋白质的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 结构基因的核苷酸序列 推测 推测 目的基因 化学合成 2.基因文库的构建方法与目的基因的获得 上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？ 根据已知氨基酸合成DNA法 反转录法 鸟枪法 缺点 优点 操作简便广泛使用 工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因 专一性强 操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高 专一性最强 仅限于合成核苷酸对较少的简单基因 思考:为什么要构建基因文库?直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗? PCR技术—聚合酶链式反应 概念： 原理： 前提： PCR扩增仪 DNA双链复制的基本原理 一段已知目的基因的核苷酸序列 是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术 四种脱氧核苷酸dNTP 一对引物 热稳定DNA聚合酶(Taq酶） 模板DNA (含有目的基因) 温度控制 条件： ④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循 环的次数） ⑤结果： 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增 指数 2n ⑥过程： a、DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板 在热作用下，_____断裂，形成___________ b、退火（复性55℃-60℃）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部________。 c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从 引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补 的________。 氢键 单链DNA 双链 DNA链