质粒d空na的提取与检测.pptVIP

影响迁移率的因素 DNA分子的大小、琼脂糖凝胶的浓度、DNA的构象、所加电压（一般5V/cm）、电场方向、嵌入染料的存在、电泳缓冲液的组成等。 常用染料 EB:溴化乙锭（ 3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴盐Ethidium　Bromide，EB），EB能插入DNA分子碱基对之间，导致EB与DNA结合。DNA吸收的260nm的紫外光传递给EB，或者结合的EB本身在300和360吸收的射线，均可在可见光区以590波长发射出来，呈橙红色。 EB染料优点：染色操作简便，快速，室温下15-20min；不会使核酸断裂；灵敏度高，10ng或更少的DNA即可检出；可以加到样品中可胶中。 EB是诱变剂，使用时一定要戴手套。 EB废液要经过处理才能丢弃。 SYBR:新型低毒，高灵敏度染料，加入样品中，价格较昂贵。 一、实验目的　　 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。 二、实验原理 DNA在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。 核酸为两性分子，在pH3.5时，整个分子带正电,pH8左右时，碱基几乎不解离，整个分子带负电。 在碱性环境下，相同碱基数量的双链DNA几乎具有等量的净负电荷，能以同样的速度向正极方向移动。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，可以近似用于估算分子的大小。 可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。 　共价闭环超螺旋DNA（cccDNA）＞直线DNA（LDNA，2条链发生断裂）＞开环的双链环状DNA（ocDNA，1条链发生断裂）。 三、仪器、材料与试剂 （一）仪器：　稳流稳压电泳仪　 （二）材料　 1.自已提取的质粒DNA 2.相对分子质量标准品 （三）试剂　 1．5× TBE储液(pH8.0)　使用时稀释 10倍，成0.5×TBE （1×TBE也可）。 2．凝胶加样缓冲液　0.2%溴酚蓝，50%蔗糖 3. 琼脂糖 4.10mg/ml溴化乙锭溶液（EB），4℃保存。用时稀释成5ug/ml的EB。 常用的电泳缓冲液 4℃ 保存备用. 四．操作步骤 琼脂糖（1%）凝胶电泳 称取一定量琼脂糖凝胶，按1g中100ml的量加入电泳缓冲液，微波炉中加热约2min，使琼脂糖溶解； 溶液冷至60 ℃，加入 EB至终浓度为0.5μg/ml，混匀，注意戴手套操作； 将琼脂糖倒入电泳板中，使凝胶厚度约为0.3-0.5cm，迅速插上梳子，检查有无气泡； 待凝胶完全凝固后（约30min），小心取出梳子，将凝胶板置于电泳槽中，加入电泳buffer，让液面高出胶面1mm； 在DNA样品（１０－３０ul）中加入1/6 loading buffer，混匀后用移液枪将样品加入样品孔中电泳，电压降选择为1-5V/cm （长度以两个电极之间的距离计算）； 根据指示剂的位置，判断是否终止电泳; 在紫外灯下／凝胶成像仪上观察电泳结果。 返回目录 五、实验结果与讨论 根据观察结果，绘图。 分析自提质粒的情况。 pGFP pBSK M 图1的电泳结果不是很好，一方面上样量太大不同构象的质粒分子没有分开；另一方面有些样品RNA去除得不好，在电泳结果上可以看到大团的荧光；此外还要注意上样的技巧，上样后稍沉降一会，使样品均匀地分布于上样孔的底部再开始电泳，这样走出的条带会较均匀。图3的结果较好。 六．注意事项 为提高质粒产量，要注意下面两个步骤： 加入溶液I 后，涡旋振荡应充分打散菌体使之均匀悬浮； 加溶液II裂解要完全(快速轻柔颠倒5~10次) ，使蛋白质和核酸变性； 加溶液III后pH要达到中性(轻柔振荡5~10次 )，使质粒DNA复性，这样才能使质粒DNA与染色体DNA完全分开，否则，难分开，所以裂解和复性这两步要从严掌握。 返回目录 * 动画效果 * 有链接！！！！ * 不 * * 质粒DNA的提取及检测 薛亚男 　　　质　粒（plasmid） 是染色体外小型（1-200kb）的共价、闭合、环状的双链DNA分子（cccDNA），能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。 常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性、产生抗生素、限制酶、修饰酶等 质粒的复制：严紧型复制（1~n个） 　　　　　　　松弛型复制（20个以上） 常用的质粒载体 是通过DNA重组技术构建而成的。pUC18, pUC19 　　　　Ampr抗性基因 Ampr抗性基因编码一种周质酶（β-内酰胺酶）可特异地切割Amp的β-内酰胺环，从而使其失去杀菌能力 质粒提取的思路 质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNA 要去除的物质： 　蛋白 　基因组DNA 　脂类及小分子杂质 　RNA