实验十三动物组织核酸的分离、末鉴定和含量测定.pptVIP

动物组织核酸的分离纯化及鉴定 1. 猪肝DNA和RNA的分离 2. 核糖和脱氧核糖的显色实验 3. 核酸的定量和纯度测定 DNA和RNA的结构 组成核酸的戊糖有两种。DNA所含的糖为 β-D-2-脱氧核糖；RNA所含的糖则为β-D-核糖。 1. 猪肝DNA和RNA的分离 核酸分离的原则 核酸存在于多种细胞，因此分离方法复杂而多样。又因各种DNA、RNA的含量差异，各种分析方法对核酸的纯度及量的要求有差异，因此在实验前应对所采用的方法有所了解和选择。总的说来核酸的分离与纯化是在溶解细胞的基础上，利用苯酚等有机溶剂抽提（核酸溶于缓冲液，即水相），分离，纯化；利用乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀，收获。 核酸分离的一般步骤 DNA和RNA分离的基本原理 根据核糖核蛋白与脱氧核糖核蛋白在一定浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同进行分离，然后用蛋白质变性沉淀剂去除蛋白，使核酸释放出来，再利用核酸不溶于乙醇的性质将核酸析出，达到分离DNA和RNA的目的。 在0.14mol/L的氯化钠溶液中，RNA核蛋白溶解度大，而DNA核蛋白溶解度小；相反在1mol/L的氯化钠溶液中，DNA核蛋白的溶解度大，而RNA核蛋白的溶解度小，从而使DNA和RNA核蛋白分开。 酚：氯仿：异戊醇抽提 酚：有效的使蛋白质变性，不能完全的抑制RNA酶的活性，能溶解带有长poly(A)的RNA分子。使用前必须用水饱和并用Tris平衡至pH7.8，以防止DNA分配到有机相。结晶酚要在182度下重蒸去除醌类等氧化产物，这些物质能够引起磷酸二酯键的断裂或促进核酸交联。纯酚的比重为1.07，有机相和水相有时很难分开。 氯仿：纯酚的比重为1.07，有机相和水相有时很难分开。加入氯仿（比重为1.47）可以避免这一问题。同时，酚有时会微溶于水。可以用氯仿将水相中的酚去除。 异戊醇：减少泡沫的产生。 实验步骤 2. 核糖和脱氧核糖的显色实验 加热条件下： D－核糖＋浓盐酸＋苔黑酚 绿色 D－2－脱氧核糖＋酸＋二苯胺 　蓝紫色 DNA：1ml SC溶液溶解DNA，然后转移到50ml离心管中，用9ml 0.01M NaOH溶液溶解，4000rpm离心10分钟，上清转移到试管中备用。各取上述1mlDNA溶液于两个试管中，其中一个里面加入3ml地衣酚试剂，然后在沸水中20min，观察颜色反应；另外一只试管中加入2ml二苯胺试剂，60 ℃条件下反应1h，观察颜色反应。 RNA：将RNA沉淀用2ml蒸馏水溶解，然后转移至2只试管中，每只1ml。其中一只试管中加入3ml地衣酚试剂，然后在沸水中20min，观察颜色反应；另外一只试管中加入2ml二苯胺试剂，60 ℃条件下反应1h，观察颜色反应。 3. 核酸的定量和纯度测定 紫外分光光度法（此法要求核酸纯度很高，1个Abs相当于50ug/ml双螺旋DNA,除了定量测定以外还可进行核酸纯度的检测，A260/A280比值，纯的DNA为1.8，RNA为2.0，样品中含有蛋白质和苯酚时， A260/A280 比值降低。） 定糖法（DNA糖部分为脱氧核糖，RNA糖部分为核糖，分别可以进行二苯胺显色法和地衣酚显色法） 定磷法（核酸的磷酸部分） 二苯胺显色法原理 实验方法 A260测定:以H2O作为空白，取上清测A260值后确定稀释倍数，使A260值在2.0左右（DNA此时的浓度约为100ug/ml。（由于二苯胺法的测定范围是40-400ug/mlDNA，所以DNA浓度如果太小会影响测定结果） A280测定： A260/A280比值计算。纯的DNA为1.8，RNA为2.0。如果样品中混有RNA，则比值大于1.8；如果样品中混有蛋白质，则比值小于1.8。 所用的DNA溶液为前面提取后溶解的DNA样品。 DNA标准曲线的制作和样品测定 DNA含量计算 DNA含量计算：以样品的光密度，根据标准曲线计算出相对应DNA含量。并同紫外法测定的值进行比较。 附 注：二苯胺试剂具有腐蚀性，且二苯胺反应产生的蓝色不易褪色，操作中应防止洒出，比色时，比色杯外面一定要擦干净。 实验报告要求 实验结果以研究论文形式提交电子版本。 包括摘要、前言、实验材料和实验方法、实验结果和分析、讨论和参考文献。 * * 核酸是一类生物高分子化合物，存在于一切生物体内，是组成细胞的重要成分。它以与蛋白质结合的形式——核蛋白存在于细胞中，是生命的基本物质之一，具有储存、复制生物体遗传信息的功能，也是蛋白质合成不可缺少的物质，因此它对于生物体的生长、遗传、变异等现象起着重要的决定作用。核酸分为两大类——核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA) 。 核酸完全水解产生嘌呤和嘧啶等碱性物质、戊糖（核糖或脱氧核糖）和磷酸的混合物。核酸部分水