互花米草mts基因的克隆及其对重金属的应答分析-植物学专业论文.docxVIP

烟台 烟台大学硕士学位论文 万方数据 万方数据 烟台大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明： 所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工 作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体 已经发表或撰写过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已 在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文使用授权说明 本人完全了解烟台大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本； 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在非保密的论文范围内，学校可以公布论文的部分或全部内容。 （保密论文在解密后遵守此规定） 论文作者签名： 导师签名： 日期： 年 月 日 摘要 金属硫蛋白（metallothionein，MT）是一类广泛存在的低分子量、富含半胱氨酸 的金属结合蛋白。有研究报道，植物 MTs 在解除重金属毒害、维持金属离子稳态和 清除活性氧（ROS）等方面起重要作用。 本实验以互花米草（Spartina alterniflora Loisel.）为材料，研究了互花米草幼苗 在不同浓度 CdSO4（0, 0.1, 0.5, 0.8, 1.0, 3.0, 5.0, 10.0 mmol/L）处理下 SaMT1、SaMT2、 SaMT3 基因的表达变化及互花米草幼苗根和叶中抗氧化酶活性的变化；克隆了互花 米草 3 个 MT 基因，分别命名为 SaMT1、SaMT2 和 SaMT3；构建过量表达载体转化 拟南芥，对获得的纯合转基因拟南芥进行分子鉴定及重金属耐受性分析；构建原核 表达载体转化大肠杆菌 BL21，对重组菌进行重金属耐性和结合特性分析。其主要结 果如下： 1.SaMTs 的表达参与了互花米草幼苗对 CdSO4 胁迫的应答 用不同浓度 CdSO4 处理互花米草幼苗 2 天，实时定量 PCR 分析显示 SaMT1、 SaMT2 和 SaMT3 的转录明显受到 CdSO4 的诱导。在低浓度 CdSO4 处理下，SaMT1、 SaMT2 和 SaMT3 基因的表达水平随着 CdSO4 浓度的增加而逐渐升高；高浓度 CdSO4 胁迫时，表达量又有所下降。 2.在一定浓度范围内，互花米草幼苗可以通过提高抗氧化酶的活性来抵御重金属胁迫 用不同浓度 CdSO4 处理互花米草幼苗 14 天后测定各项生理指标。实验结果显示 根和叶中 MDA 含量和相对电导率都持续升高。随着 CdSO4 浓度的增加，抗氧化酶 类（SOD、APX、CAT、POD）的活性出现先升高又下降的趋势。 3.运用 RACE 方法克隆得到了互花米草 SaMT1、SaMT2 和 SaMT3 基因 SaMT1、SaMT2、SaMT3 序列的 ORF 区长度分别为 222 bp、246 bp 和 195 bp， 分别编码 73、81 和 64 个氨基酸；Blast X 分析和系统进化树分析发现 SaMT1、SaMT2 和 SaMT3 与其他植物 MTs 同源性很高，尤其是水稻 MTs。 4.SaMTs 的表达能够提高转基因拟南芥的抗氧化酶活性，增强重金属抗性 构建植物过量表达载体，渗透法转化拟南芥，分别筛选得到了 6 个过量表达 SaMT1、9 个过量表达 SaMT2 和 11 个过量表达 SaMT3 的纯合转基因拟南芥株系。 实时定量 PCR 技术检测转录水平差异，分别选取 2 个表达量相对较高的株系进行生 理指标测定。转基因拟南芥的抗氧化酶活性都比野生型拟南芥高，而 MDA 含量和相 对电导率比野生型低。 I 5.SaMTs 的表达能够增强重组菌的重金属抗性和结合重金属的能力 构建原核表达载体，转化大肠杆菌 BL21 感受态细胞，对重组菌进行重金属耐性 和结合特性分析，结果显示在 CdSO4 胁迫下表达 SaMT1、SaMT2 和 SaMT3 的重组菌 比对照菌能更好的生长，并且结合 Cd 的含量分别是对照菌的 1.95、2.7 和 2.17 倍。 关键词：互花米草；SaMT1、SaMT2 和 SaMT3；拟南芥；原核表达；重组蛋白 II Abstract Metallothioneins (MTs) are a kind of widespread metal-binding proteins with the characteristics of low molecular weight and high cysteine residue content. The researches reported that, the roles of