缺血预处理大鼠心肌细胞中的bc走l-2蛋白对线粒体通透性转.pptVIP

* 缺血预处理大鼠心肌细胞中的Bcl-2蛋白对线粒体通透性转换孔的影响 制作者：基础医学0201班第二组（赵金方、吴丹霄、王俐） 背 景 缺血预处理（IPC）是迄今保护缺血/再灌注（I/R）心肌的最强效方式之一。缺血/再灌注损伤致心肌细胞死亡有凋亡和坏死两种形式。IPC心肌保护作用主要表现在缩小心肌梗死面积。线粒体是细胞关键的细胞器之一，它在供能、调节渗透压、钙稳态，PH值以及细胞信号传导中起了重要作用。 线粒体通透性转换孔（MPTP）是位于线粒体内外膜间由多个蛋白质组成的复合孔道，又称线粒体大通道，是线粒体内外信息交流的中心枢纽，功能的发挥依赖于其开放状态。根据细胞环境的不同，MPTP可有3种开放状态，一种是完全关闭状态，一种是可逆性的低水平开放状态，另一种是不可逆的高水平开放状态。MPTP高水平开放的直接效应是导致线粒体质子－电化学梯度耗散、离子稳态打破、线粒体肿胀和ATP水解，这些效应最终激发细胞死亡。细胞色素C等凋亡效应因子从线粒体释放是MPTP调控细胞凋亡的关键。 Bcl-2家族蛋白是在细胞凋亡过程中起关键性作用的一类蛋白质。在线粒体上，Bcl-2家族蛋白通过与其他凋亡蛋白的协同作用，调控线粒体结构与功能的稳定性，发挥着细胞凋亡“主开关”的作用。Bcl-2家族包括两类蛋白质：一类是抗凋亡蛋白，另一类是促凋亡蛋白。平时被隔离在线粒体等细胞器内的该家族的抗凋亡蛋白成员（如Bcl-2蛋白）则抑制细胞色素C和凋亡诱导因子等促凋亡因子的释放，具有抑制细胞凋亡的功能。 由于两者都是通过引起细胞色素C等物质浓度的改变来发挥作用，但是这两者之间是否存在直接联系尚不清楚。本实验旨在于研究Bcl-2蛋白是否会对MPTP的开放情况产生影响。 实 验 设 计 将实验动物分为三组： 正常对照组 缺血再灌组 缺血预处理组 比较三者的Bcl-2蛋白的含量和MPTP的开放程度 材 料 实验动物：SD大鼠 实验药品：戊巴比妥钠，抗鼠Bcl-2抗体及SP免疫组化 试剂盒,分离缓冲液A 实验仪器：呼吸机，分光光度计，低温高速离心机 方 法 1.建立动物缺血模型 大鼠用戊巴比妥钠麻醉后，用止血钳游离大鼠左侧的胸大肌，暴露左第2，3，4肋，分别在左第2，3，4肋间隙距离胸骨左缘约0.5cm处进针穿线，每个肋间隙同一进针点穿两根长约40cm的0号手术线，再将两根线用力拉向两侧，分开肋间肌和软组织并结扎肋间动脉，留取结扎线的剩余部分，将两根结扎线剩余部分用力拉向两侧拉开胸腔，并固定之。充分暴露心脏及其表面的血管，剪开心包膜，结扎冠状动脉前降支，结扎之前在预结扎的冠状动脉前降支处放置一根约0.5cm长直径1.5mm的乳胶管，打一个活结结扎，以备进行反复多次缺血再灌实验。 2.将实验动物分为三组： 正常对照组：穿线但不做结扎处理，持续灌流。 缺血再灌组：结扎30min，再灌注20min。 缺血预处理组：连续3次停灌3min+复灌 5min，然后 缺血30min，再灌注20min。 3.Bcl-2蛋白含量的测定 取心尖以上缺血梗死区横切2mm厚心肌，用免疫组化sp法测定心肌Bcl-2的含量 4.心肌线粒体的制备 取左前壁心肌组织，转移至分离缓冲液A中冲洗、剪碎、匀浆。用低温高速离心机分离线粒体。 *