茚三酮显色法测定氨基系酸含量.pptVIP

实验三茚三酮显色法测定氨基酸含量 一、实验原理 　 茚三酮溶液与氨基酸共热，生成氨。氨与茚三酮和还原性茚三酮反应，生成紫色化合物。颜色的深浅与氨基酸的含量成正比，可通过测定570nm处的光密度，测定氨基酸的含量 　 三、操作方法 1、标准曲线的制作 分别取0， 0.2, 0.4, 0.6, 0.8,1.0ml0.3mM的标准氨基酸溶液于试管中，用水补足到1ml。各加入1ml2M醋酸缓冲液；再加入1ml茚三酮显色液，充分混合后盖住试管口，在100℃水浴中加热15min，用自来水冷却。放置5min后，加入3ml60%乙醇稀释，充分摇匀，用分光光度计测定OD570（脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，应测定OD440）。以OD570为纵坐标，氨基酸含量为横坐标，绘制标准曲线。 2、氨酸酸样品的测定： 取样品液1ml，加入pH5.4,2M醋酸缓冲液和茚三酮显色液各1ml混匀后于100℃沸水中加热15min，自来水冷却。放置5min后，加3ml60%乙醇稀释，摇匀后测定OD570（生成的颜色在60min内稳定） 将样品测定的OD570与标准曲线对照，可确定样品中氨基酸的含量 样品同时做三份取平均数 四、结果与计算 氨基酸的含量(g/100ml)=X*100 ——X为查标准曲线所获得每ml含量g数 自配样品 ——X*250/称取克数（X为查标准曲线所获得每ml含量g数） ——250为稀释的倍数 五、讨论与分析 六、思考题 茚三酮是否可用于氨基酸和蛋白质的定性鉴定？ * 二、试剂与材料 （1）标准氨基酸溶液：配制成0.3mM溶液（本实验用赖氨酸）(已配) （2）pH5.4,2M醋酸缓冲液：量取2M 86ml醋酸钠溶液，加入14ml 2M乙酸混合而成。用pH计较正（250ml/班） （3）茚三酮显色液：称取85mg茚三酮和15mg还原茚三酮，用10ml乙二醇甲醚溶解（15ml/组） 还原型茚三酮按下法制备：称取0.5g茚三酮，用12.5ml沸蒸馏水溶解，得黄色溶液。将0.5g维生素C用25ml温蒸馏水溶解，一边搅拌一边将维生素C溶液滴加到茚三酮溶液中，不断出现沉淀滴定后继续搅拌15min，然后在冰箱内冷却到4℃，过滤、沉淀用冷水洗涤3次，真空干燥，置五氧化二磷真空干燥器中保存备用 （4）60%乙醇（50ml/组 ） （5）样品液：每ml含0.5-50ug氨基酸（已配） （6）分光光度计 （7）水浴锅 *