免疫组化5-册结果的分析和判断.pptVIP

对照结果判断： 假阴性常见原因：抗原丢失或减弱 抗体失效或稀释度不当 操作失误 假阳性常见原因：抗原弥散 抗原异位表达 病变中正常组织残留 抗体交叉反应 内源性物质着色 免疫组化染色的基本要求： ①实验切片的阳性抗原定位准确，呈色鲜明，背景着色浅或无 ②对照染色的结果应附合要求。否则，所得实验结果都是错误的，或为假阳性或为假阴性。 实验切片呈阳性，阴性组织对照或阴性试剂对照也呈阳性 原因：内源性干扰，试剂不纯，交叉反应等 假阳性 实验切片呈阴性，阳性组织对照及阴性试剂对照也均呈阴性的结果 原因：组织处理不当，组织细胞抗原丢失或试剂错误(如漏加、错加、失效、变质等),操作失误等 假阴性 表中1～5结果无效，6、7结果可靠 （＋） （＋） （＋） （－） （＋） （＋） （－） 检测标本含抗体，结果可靠 （＋） （－） （－） 7 检测标本不含抗体结合可靠 （－） （－） （－） 6 非特异染色 （＋） （＋） （－） 5 阳性对照不含定位抗原 （＋） （－） （－） 4 阴性对照内含定位抗原 (＋)(－) （－） （＋） 3 非特异性染色 （＋） （＋） （＋） 2 抗体失活，操作有误 （－） （－） （－） 1 结果判断 检测结果 替代对照 阴性对照 阳性对照 免疫组化结果的分析和判断 一、 免疫组化结果的判断原则 ? ⒈必须同时设对照染色。没有对照染色的免疫组化染色结果是不可信的。 ⒉抗原表达必须在特定部位。如LCA应定位在细胞膜上；CK应定位在细胞浆内； PCNA及p53蛋白应定位在细胞核内；EMA应定位在细胞膜上，等等。不在抗原所在部位的阳性着色，一概不能视为阳性。 ? ⒊阴性结果不能视为抗原不表达。由于检测方法灵敏度有高低之分，有时可因染色方法灵敏度不够，而导致阴性反应，判断时应注意。 ? ⒋尽量避开出血、坏死及切片刀痕和界面边缘细胞的阳性表达，特别是酶免疫标记。因为这类阳性着色多系内源干扰，或系人为因素所致。 ? ⒌对免疫组化标记结果的意义不能绝对化，应结合临床资料、X线等影像学及实验结果综合分析。 二、对照染色设计 (一）对照染色的目的 ---排除假阴性和假阳性。 假阴性的原因主要有三： ①组织处理不当，抗原丢失过多或被遮蔽 ②抗体失活、效价过低或稀释度不合适（主要指一抗，即特异性抗体） ③染色步骤遗漏及差错，或显色剂的选择、缓冲液的pH和离子强度不当等。 假阳性系由多种因素造成的非特异着色所致，原因主要有： ①自发荧光或内源酶等干扰 ②抗体试剂不纯(特别是一抗） ③操作失误，如污染、切片干枯或显色剂操作不当等 ④Fc受体的干扰，等等 （二）对照的种类及其选用目的 对照染色大致可分为：阳性组织对照、阴性组织对照及阴性试剂对照和自身对照四大类： ⒈阳性组织对照 用已证实含有靶抗原的同源及不同源组织切片或细胞涂片与待检实验切片同时作同样处理和免疫染色的组织对照。正确的结果应呈现阳性 目的：证实所用免疫组化染色流程的有效性，排除假阴性的可能。 ⒉阴性组织对照 用已证实不含靶抗原的同步处理和免疫标记染色的组织对照。正确的结果应为阴性 目的：排除假阳性的可能。 3、阴性试剂对照 用于证实在免疫组化染色中所用试剂，尤其是特异性抗体试剂的有效性和可靠性而所设立的同步免疫染色对照，包括有：空白对照；替代对照；吸收试验和抑制试验等。 目的：排除假阳性和证实所用免疫组化试剂及其技术方法的有效性和待检实验切片免疫标记阳性结果的可靠性。 ⑴空白对照 以缓冲液（PBS、TBS等）取代第一抗体（主要的，必要时还可做第二抗体及桥联抗体的空白取代），其他各步不变的试剂对照染色，结果应为阴性。 ⑵取代对照 指以所用方法第一抗体同源动物的正常血清，或与本实验无关的抗体(靶生物缺如的)取代第一抗体，其他步骤不变的试剂对照染色，结果应为阴性。 ⑶吸收试验 是指用事先经过量抗原吸收的第一抗体上清液取代第一抗体，其他步骤不变的免疫染色试剂对照。结果应是阴性或阳性着色明显减弱（吸收不全时）。 ⑷抑制试验 是指用标记抗体和未标记抗体（可以是一抗，也可以是二抗或桥抗体）两者的混合物作试剂，其他步骤不变的免疫组化染色试剂对照，结果其阳性着色应成比例的减弱（等量或1：9）。此试剂对照多用于直接法。 这类阴性试剂对照的选用原则是：①空白对照不能省，其他对照在预实验中应尽量多做，尤其是应用新抗体试剂②对照必需与实验片同步进行染色 ③对照的结果应附合要求。 ⒋自身对照 是指在同一标记切片上的自身组织成分的阴性