基因工程PCR技术..pptVIP

PCR仪 微量离心管 一 次 性 吸液枪头 调节轮 卸枪头按钮 推动按钮 卸枪头器 微量移液器 （二）实验操作步骤 （一）理论上DNA扩增数目的计算 七、课题成果评价 1 、一条DNA，复制n次， DNA为2n 2 、 a条DNA，复制n次， DNA为a x2n （二）实验中DNA含量的测定原理 　　可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关。 光吸收 波长／nm 260 240 220 280 0.1 0.2 * * * * 多聚酶链式反应扩增 DNA片断 ★　分子生物学研究中最强大的实验技术之一 ★　其本质是在体外模拟胞内DNA分子复制的过程 美国科学家　穆利斯(K.B.Mullis) 发明了PCR技术　1993年诺贝尔奖 一、多聚酶链式反应 是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。 　　能以极少量的DNA为模板，在几小时内 复制出上百万份的ＤＮＡ拷贝。 　　广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破案、 古生物学、基因克隆和DNA序列测定等。 二、DNA分子的结构 1、基本组成单位——脱氧核苷酸 脱 氧 核 苷 酸 脱氧核苷 磷酸 脱氧核糖 含氮 碱基 嘌呤 嘧啶 腺嘌呤（A） 鸟嘌呤（G） 胞嘧啶（C） 胸腺嘧啶（T） 脱氧核苷酸结构式 3 5 　　一个核苷酸上的磷酸基团上的“－OH”和另一个核苷酸分子的第三位碳原子上的羟基之间失去一分子水，形成磷酸二脂键，即在相邻的两个脱氧核苷酸的 3’和5’碳原子之间形成磷酸二脂键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过3’、5’、磷酸二脂键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。通常将DNA的羟基 “－OH”末端称为 3’端，而磷酸基团的末端称为5’端。 2、多脱氧核苷酸链的形成 O O P O HO 碱基 O OH O O P O HO OH 碱基 5’ 3’ 3’ 5’ 碱基 脱氧核糖 磷酸基团 碱基 脱氧核糖 碱基 脱氧核糖 5’ 3’ 多脱氧核苷酸链结构简图 3、DNA分子的双螺旋结构特点 ① DNA分子是由两条反向平行的（即一条链为3’－5’，另一条链为5’－3’ ）脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则双螺旋结构。 ②脱氧核糖与磷酸交替连结，排列在外侧，构成基本骨架；碱基排列在链的内侧。 ③两条链上的碱基通过氢键连结起来，形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺嘌呤一定与胸腺嘧啶配对，鸟嘌呤一定同胞嘧啶配对。 三、DNA的复制 2、时期 有丝分裂间期或减数第一次分裂前的间期 3、场所 细胞核（主）（线粒体、叶绿体） 4、模板 DNA母链 1、概念 由一个DNA形成两个完全相同的DNA的过程 5、原材料 脱氧核苷酸 6、基本条件 酶、ATP、原料、模板 7、复制过程 ① DNA的解旋 亲代DNA分子利用细胞提供的能量在解旋酶的作用下氢键断裂，部分双螺旋链解旋为两条平行的双链 ② RNA引物的合成 　　以单股DNA为模板，在引物酶的作用下合成小段的RNA引物。 ③ DNA的生成 　　以单股的DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下，在RNA引物的末端由5’端→3’端合成DNA。 边解旋边复制(过程） 8、复制特点 半保留复制（结果） 9、遵循原则 碱基互补配对原则 10、精确复制的原因 11、复制的意义 　　DNA分子通过复制使遗传信息从亲代传给了后代，从而保持了遗传信息的连续性。 ①规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板 ②碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行 参与的组分 在DNA复制中的作用 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物 总结：胞内DNA复制的基本体系 打开DNA双链 提供DNA复制的模板 合成子链的原料 催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 四、 PCR(多聚酶链式反应） 1、 PCR原理 ①在80－100℃的温度范围内， DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。 ②当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。 ③ PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器。 变性 复性 延伸 加热到90℃，DNA双链 解旋为单链 降到50℃，引物通过碱基 互补配对与单链DNA结合 升温到72℃，四种脱氧核苷酸 在DNA聚合酶的作用下，根据 碱基互补配对原则合成新的DNA链 2、细胞内和细胞外DNA复制环境的区别 体内DNA的复制 体外的模拟 模板（母链） 引物 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 反应环境 细胞内源 引物合成酶 细胞内源 细胞内源 细胞内环境 外源加入 外源加入 外源加入 外源加入 缓冲液 ① PCR过程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA单链，其长度通常