实验一-试专剂的配制.pptVIP

一、实验目的 通过本实验，掌握常用LB液体/固体培养基和质粒提取试剂的配制方法和技术，为后续实验做准备 二、实验仪器 电子天平 pH酸度计 磁力搅拌器 TOMY SS-325/245自动蒸汽灭菌锅 电子天平 pH酸度计 磁力搅拌器（配搅拌子） TOMY SS-325/245自动蒸汽灭菌锅 检查排放蒸汽的水壶，使腔体内的水位与托板齐平 SET键设置温度和时间（121℃，20min） 关闭排气阀，Start机器开始运行，Check Heat检查设置的温度，Stop键终止机器运行 程序运行结束，旋开排气阀或机器自行排气至压力为0。温度降至80℃以下压力为0时方可开盖。运行过程中勿接触盖子 腔体内经常清洁 LB液体培养基 25ml/2瓶+50mL/3瓶 LB固体培养基（150ml/2瓶）——每150ml液体培养基中加2.25g琼脂 溶液Ⅰ（pH8.0，100ml） 0.4mol/L NaOH（100ml） 2％SDS（100ml） 溶液Ⅲ（pH4.8，100ml） 70％乙醇（100ml） 50×TAE（200ml） 四、试剂灭菌 LB液体/固体培养基 溶液Ⅰ 50×TAE 五、思考题 分子生物学实验中，为什么要对器具和耗材等进行清洗和高温湿热灭菌？如果不灭菌，可能会对实验产生怎样的影响？ 怎样配制LB液体/固体培养基？ 用碱裂解法提取质粒，在配制溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ时，为什么要使用pH酸度计调节三种溶液的pH值？ TOMY灭菌锅的使用注意点有哪些？ * * 实验一：LB固体/液体培养基及质粒提取试剂的配制 FA/JA系列 称量范围：0～200g 读数精度：0.1mg（FA2004）1mg（JA2003） 称盘直径：80mm（FA2004）110mm（JA2003） 预热时间：120min（FA2004）60min（JA2003） 将天平置于稳定的工作台上，避免振动、阳光照射和气流 使用前观察水平仪，使水泡位于水平仪中心 接通电源，开始通电工作（显示器未工作），通常需预热后方可开启显示器，进行操作使用 ON开启显示器键/OFF关闭显示器键/TAR清零、去皮键 210A酸度计 标准配置：210A主机1台，9V电池1块，910600pH电极1支，pH4.01缓冲液，pH7.00缓冲液，pH10.01缓冲液 Mode键用来改变模式：MEASURE－CALIBRATE－SETUP 用蒸馏水冲洗电极，用纸巾把电极附着的水分吸干，然后将电极插入第1点缓冲液（pH7.00），均匀搅拌缓冲液 按mode键至屏幕上部显示CALIBRATE，屏幕下部出现7－4，表示用7.00和4.01的缓冲液校正，按no键可以选择7－10/SET/7/7－4 当屏幕下部显示7－4或7－10时，压yes键确认 屏幕出现P1，当屏幕出现ready时，第1点校正完成，压yes键确认，仪器进入准备第2点校正，屏幕出现P2 将电极从第1点缓冲液中取出，蒸馏水清洗并用纸巾吸干后，将电极插入第2点缓冲液，均匀搅拌缓冲液，当屏幕出现ready时，第2点校正完成，压yes键确认，屏幕显示电极2点校正后的斜率值，仪器自动回到测量状态 将电极取出，蒸馏水清洗并用纸巾吸干后，即可测量样品溶液 溶液Ⅱ 三、试剂配方及配制的操作步骤 76，79页 （1） LB液体培养基 将胰蛋白胨（typtone） 10g 酵母提取物（yeast extract）5g 氯化钠 10g 完全溶解在950mL去离子水中，用NaOH调节pH至7.0，加入去离子水至总体积为1L，121℃湿热灭菌20min。冷却后4℃保存备用。 （2） 固体LB培养基：每升LB培养基中加15g琼脂 1. LB液体/固体培养基（76页） 2. 氨苄青霉素(Amp)：用无菌水配制成100mg/mL溶液，置－20℃冰箱保存。 3 溶液Ⅰ 50mmol/L葡萄糖 25mmol/L Tris·HCl(pH8.0) 10mmol/L EDTA(pH8.0) 称量→溶解→调节pH值→定容→灭菌 4 溶液Ⅱ 0.4mol/L NaOH 2%SDS 用前等体积混合。 称量→溶解→定容 5 溶液Ⅲ (pH4.8) 5mol/L 乙酸钾 60mL 冰乙酸 11.5mL 水 28.5mL 79页 6 70%乙醇：放置于－20℃冰箱保存，用后即放回。 7 胰RNA酶 将RNA酶溶于10mmol/L Tris·HCl(pH7.5)、15mmol/L NaCl中，配成10mg/mL浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，保存于－20℃。 8 平衡酚(pH8.0) (购于申能博彩公司) 9.