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PCR技术及其延伸与应用 刘红亮 05.03.08 聚合酶链反应或多聚酶链反(Polymerase Chain Reaction, PCR）又称无细胞克隆技术(“free bacteria”cloning technique) 特定的DNA片段在体外进行快速扩增的新方法。 在数小时内可使几个拷贝的模板序列甚至一个DNA分子扩增107～108倍，大大提高了DNA的得率。 PCR技术最早由美国Cetus公司人类遗传研究室Kary Mullis及同事于1985年发现并研制成功的； 最早的应用报道是Saiki等1985年将PCR技术应用于β-珠蛋白基因扩增和镰刀状红细胞贫血的产前诊断。 使用1976年Chien等分离的热稳定性Taq DNA聚合酶，使PCR操作大为简化，并使PCR自动化成为可能； 1987年Kary Mullis等完成了自动化操作装置，使PCR技术进行实用阶段。 PCR已获得广泛应用,目前，每年都有上千篇文章发表。 1991年，期刊“PCR方法与应用”（PCR Methods and Application）在美国创刊，使有关学者有了自己的论坛和参考的专业期刊。　　 Kary Mullis因发明了“聚合酶链式反应”而获得1993年度诺贝尔化学奖。(一名加拿大籍英国科学家Michael Smith因开创了“寡核苷酸基因定点诱变”的方法而与Mullis同享此荣) 瑞典皇家科学院说：“PCR方法已经广泛应用于生物医学中,该方法同DNA测序法结合起来很可能将成为研究动植物分类学的一种革新工具。” 现在世界各地都在使用PCR检测病人血液中的微量遗传物质，这一成就为精确诊断艾滋病及其它病症铺平了道路。 PCR技术作为一种方法学革命，必将大大推动分子生物学各有关学科的研究，使其达到一个新的高度。 PCR的基本原理和基本程序 变性:先将含有所需扩增分析序列的靶DNA双链经热变性处理解开为两个寡聚核苷酸单链， 退火:加入上下游引物，与互补链杂交复性。 延伸:在Taq DNA聚合酶的作用下以4种三磷酸脱氧核苷（dNTP）为原料按5‘到3’方向将引物延伸、自动合成新的DNA链、使DNA重新复制成双链。 循环扩增 每次循环使延伸的模板增加1倍，亦即扩增DNA产物增加1倍，经反复循环，使靶DNA片段指数性扩增。 预变性 十分钟延伸 保存 PCR扩增属于酶促反应，所以，DNA扩增过程遵循酶促动力学原理。 平台效应 靶DNA片段的扩增最初表现为直线上升，随着靶DNA片段的逐渐积累，当引物—模板/DNA/聚合酶达到一定比值时，酶的促化反应趋于饱和，此时靶DNA产物的浓度不再增加，即出现所谓平台效应 PCR的特点 特异性高-聚合酶 首次报导用大肠杆菌的DNAPolymerase I的Klenow大片段。90℃会变性失活，需每次PCR循环都要重新加入；同时引物是在37℃延伸 Taq DNA聚合酶 1988年Saiki等从温泉水中分离到的水生嗜热杆菌中提取的热稳定的，扩增过程中，单核苷酸的错误参入程度很低、其错配率一般只有约万分之一 高度敏感： 理论上PCR可以按2n倍数扩增DNA十亿倍以上。 应用证实可以将极微量的靶DNA成百万倍以上地扩增到足够检测分析量的DNA。 能从100万个细胞中检出一个靶细胞，或对诸如病人口液等只含一个感染细胞的标本或仅含0.01pg的感染细胞的特异性片段样品中均可检测。 快速 简便 可扩增RNA或cDNA 试剂 引物：决定扩增的特异性。根据检测的DNA不同，选用不同引物。 耐热的DNA聚合酶： 10×PCR缓冲液500mmol/lKCl;100mmol/L Tris-HCl(pH8.4,20℃)150mmol/L MgCl2,1mg/ml明胶。 dNTP贮备液 DNA模板 操作程序 试剂混合 PCR仪程序设计：94℃变性30s，55℃退火20s，然后在72℃延伸30s，共循环30-35次。最后一次循环结束后，再将反应管置72℃温育5min，以确保充分延伸。 PCR反应基本条件及其对PCR的影响 模板核酸 有机溶剂－酚 蛋白质污染 核酸污染 核酸的量 引 物 引物与PCR的特异性， 引物限定扩增产物的大小。 合成的引物必须经聚丙烯酰胺凝胶电泳或反向高压液相层析（HPLC）纯化。 冻干引物于-20℃至少保存12-24个月，液体状态于-20℃可保存6个月。引物不用时应存于-20℃保存。 缓冲液 缓冲液的目的：给Taq DNA聚合酶提供一个最适酶催反应条件。 目前最为常用的缓冲体系为10-50mmol/L　Tris-HCl (Tris是一种双极性离子缓冲液，pH变化于6