基因组改组选育高产l乳酸耐酸耐温米根霉及特性表征-农产品加工及贮藏工程专业论文.docxVIP

及取得的研究 及取得的研究 包含其他人已 其他教育机构 任何贡献均已 V月7日 f 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解 金肥王些太堂 有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅或借 阅。本人授权 盒胆王些太堂 可以将学位论文的全部或部分论文内容编入有关数 据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 (保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文者签名： 野前 导师 签字醐渺f『年牛月7日 签字日期： 年 月 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 电话： 通讯地址： 邮编： 基因组改组选育高产L．乳酸耐酸耐温米根霉及特性表征 基因组改组选育高产L．乳酸耐酸耐温米根霉及特性表征 摘 要 本文采用基因组改组技术选育耐酸耐温L．乳酸产生菌株。以课题组前 期诱变选育得到的米根霉耐酸突变株mat．8，mut．19及耐温突变株mut．5为 基因组改组的出发菌库，经两轮原生质体递进融合、筛选获得能够在38℃、 减少中和剂添加量的发酵条件下生长良好且产酸量和强度都得到提高改 组菌株，并对其中一株改组菌株F1．26的发酵性能进行初步研究。 通过对菌体原生质体制备影响因素试验，确定原生质体制各条件：选 择菌龄18 h的米根霉种子培养菌液，采用蜗牛酶，纤维素酶及溶壁酶按l： l：l配比，1．5 mg／mL组合酶浓度，32℃、pH为6条件下酶解2 h；缓冲液为 0．6 mol／LNaCl高渗液；原生质体再生培养方式采用含有0．6 mol／LNaCl平板 再生；可以得到原生质体制得数最高为2．74x106个／mL，再生率最高为 6．8％。 分别制各mut．8、mut．19、mut．5原生质体，利用双亲灭活标记法进行 标记，优化的灭活条件为：紫外照射180 s，50℃水浴热灭活6 rain。原生 质体融合后采用溴甲酚绿平板法初筛及发酵复筛，获得在添加40 g／L碳酸 钙中和剂条件下产酸水平较高的耐酸融合菌株F1．26。对F1．26与两亲本株 mut．8、mut．19进行对比试验得到：在发酵72 h时，L．乳酸产量分别达到最 大值91．45 g／L、76．78 g／L、75．82 g／L，F1．26比两亲本株分别提高19．10％， 20．62％；发酵42 h时，发酵强度达到最大，分别为1．67 g／L·h，1．6l∥L·h， 1．59 g／L·h；F1．26发酵终点时葡萄糖转化率达到76．21％，高于出发菌株 mut．8的65．66％和mut．19的66．51％。对调节副产物乙醇的乙醇脱氢酶 (ADH)而言，F1．26比两亲本株rout．8，mut．19ADH酶活分别降低32．33％，‘ 23．06％。调节目标产物的乳酸脱氢酶(LDH)酶活分别上升16．35％，57．52％。 第二轮基因组改组耐温耐酸菌株F2．7发酵温度从原来的32℃提高到38℃， 中和剂添加量从60 g／L减少至iJ40 g／L，发酵产L．乳酸产量为86．80 g／L。连续 传代培养与发酵结果表明该菌株具备较好的遗传稳定性，初步实现了选育 目的。 对改组前后的菌株通过双向电泳及PDQuest软件进行蛋白质表达初步 分析，表明改组后菌株在总蛋白表达及表达量与原始菌株相比差异上比较 明显。 关键词：米根霉；基因组改组；原生质体融合；L．乳酸；双向电泳：耐温 耐酸 protoplast protoplast progressive fusion，and fermentation performance of one of the mutants F I一26 was investigated． According to the results of effects of several factors on protoplasts preparation，some conditions were determined．Mut-8 seed culture medium age of 1 8 h was optimum．Snail enzyme，cellulase and lywallzyme were used for protoplast preparation with a ratio of l：1：l and concentration of 1．5％． Enzyme digestion was carried out at 32℃，pH 6 for 2 hours．0．6 mol／L NaCI hypertonic solution was served as the buffer．Protoplast regeneration was perfolrmed in cul