抗抑郁药r-托莫西汀中间体s-3-氯-1-苯左丙醇的生物合成.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 抗抑郁药(R)-托莫西汀中间体(S)-3-氯-1-苯丙醇的生物合成 研究背景 论文创新点 实验结果 主要结论与建议 1 2 3 4 研究背景 生物法制备手性药物中间体具有反应条件温和、选择性好的优点。而且使用微生物全细胞作为催化剂还可省去酶纯化与辅酶添加费用。 因此，利用生物法进行(S)-3-氯-1-苯丙醇的制备，具有重要的现实意义。 研究背景 目前对于(S)-3-氯-1-苯丙醇的制备多采用化学法不对称还原或生物化学方法拆分外消旋醇；对于生物法不对称还原前手性酮制备手性醇研究较少。 当前生物法制备手性醇最佳成果为：植物细胞作为催化剂还原3-氯-1-苯丙酮，20 mmol/L底物浓度下，反应48 h，产率达到78%，e.e.达到98% 。 论文创新点 1、筛选出一株催化性能优异的酵母，与其它相关研究进行比较，本研究可以在实现同等对映体过量率的情况下，得到更高的时空产率； 2、在水/有机溶剂体系和含离子液体的水/有机溶剂体系中不对称还原得到(S)-3-氯-1-苯丙醇，未见报道； 3、研究了单一水相体系和两相体系不同条件对还原过程中细胞膜流动性、完整性等的影响，初步探索了细胞生物学特性与不对称还原反应的关系。 实验结果与讨论 1、菌株的筛选与鉴定 2、单一水相体系中的不对称还原 3、水/有机溶剂两相体系中的不对称还原 1、菌株的筛选与鉴定 菌株的筛选 菌株 产率(%) e.e. (%) 优势产物 汉逊德巴利酵母 14.82 53.31 S Sigma面包酵母 49.27 90.09 S 毕赤酵母 NA NA -- 酵母FU5 72.43 96.22 S 高活性干酵母 70.85 94.12 S 酿酒高活性干酵母 30.29 85.31 S 表1 不对称还原酵母菌株的筛选 由表1可知，同等条件下，酵母FU5菌株对底物3-氯-1-苯丙酮具有最佳的还原产率和对映体过量率。因此，选择其做为后续实验菌株。 1、菌株的筛选与鉴定 菌株鉴定 采用ITS全长序列分析对菌株进行鉴定。 图1 酵母基因组电泳图 图2 酵母ITS序列电泳图 1、菌株的筛选与鉴定 构建系统进化树 进化树的构建以刚果锥虫（Trypanosoma congolense）ITS序列作为外类群，以担子 酵母（ Basidiomycete yeast ）ITS序列作为参照，使用NJ算法，并对进化树进行1000次可信度检验。 图3 基于ITS 序列和Neighbor-Joining 算法构建的系统发育树 2、单一水相体系中的不对称还原 表2 有氧无氧条件对不对称还原的影响 图4 底物浓度对不对称还原的影响 2、单一水相体系中的不对称还原 图5 细胞浓度对不对称还原的影响 图6 不对称还原的时间进程 产率维持恒定的原因：（1）反应达到平衡；（2）体系中细胞死亡，反应不再进行；（3）底物或产物的毒性导致细胞失去催化能力；（4）体系中存在产物抑制。 100 2、单一水相体系中的不对称还原 C产物 OD260 OD280 RGlc Viability 空白 0.501 0.223 100.0 100.0 3 0.512 0.295 95.4 97.6 6 0.583 0.325 91.6 93.4 9 0.622 0.336 78.9 82.1 12 0.705 0.328 52.0 65.5 15 0.790 0.392 23.3 38.7 在反应体系中加入产物对可能存在的产物毒性进行考察。 图7 不同浓度的产物对还原的影响 表3 不同浓度的产物对酵母的影响 说明体系中存在产物毒性。 2、单一水相体系中的不对称还原 在体系中加入环糊精、表面活性剂等添加物降低体系中的产物浓度，并考察加入这些物质对反应的影响。 图8 不同浓度的环糊精对还原的影响 图9 不同浓度的表面活性剂对还原的影响 2、单一水相体系中的不对称还原 图10 不同浓度的表面活性剂对酵母细胞的影响 Circle: CTAB Square: SDS Triangle:Tween 80 Open shape: OD260 Solid shape: OD280 3、水/有机溶剂两相体系中的不对称还原 Organic solvent log P Yield (%) e.e. (%) 1-DMF -1.0 2.15 89.44 2-乙酸乙酯 0.68 0.25 99.00 3-甲苯 2.5 0.83 82.20 4-正己烷 3.5 55.45 96.68 5-正辛烷 4.5 46