第二十六册章基因工程药物new.ppt

* * ①活性蛋白回收率高 ②正确产物易于分离 ③折叠复性后能得到浓度较高的蛋白产品 ④折叠复性方法易于放大 ⑤复性过程耗时少 有效理想的折叠复性方法的特点 第十二节 基因工程药物的质量控制 基因工程产品相对于一般药品，有着许多不同之处 ①活的细胞作为表达系统来制备产品，产品分子质量大、结构复杂 ②具有显著效应，在微量情况下就可以发挥作用，因此，产品的任何性质或数量上的偏差，都可能贻误病情甚至造成严重的伤害 ③杂质多，需严格控制产品的有效性、安全性、均一性 第十二节 基因工程药物的质量控制 一 原材料的控制 原材料的质量是要确保药品的DNA序列的准确性，重组微生物来自单一克隆，所用质量纯而稳定，以保证产品质量的安全性和一致性，所以原材料的质量控制主要是对目的基因、表达载体已经宿主细胞的检查 1 目的基因 ①需明确目的基因的来源、克隆经过 ②对于改造过的基因应说明被修饰改过的密码子、被切除的肽段及拼接方法 ③使用PCR技术扩增得到的基因，应说明扩增的模板、引物及酶反应等情况，并以限制性内切酶图谱和核苷酸序列等分析方法确证基因结构的正确无误 2 表达载体 应提供表达载体的名称、结构、遗传特性及其组成部分（如复制子、启动子等）的来源与功能，构建中所用位点的酶切图谱，抗生素抗性标记等 3 宿主细胞 ①需提供宿主细胞的的名称、来源、传代历史、检定结果及其生物学特性 ②需阐明载体引入宿主细胞的方法及载体在宿主细胞内的状态，是否整合到染色体内及拷贝数，并证明宿主细胞与载体结合后的遗传稳定性 ③提供载体插入基因与表达载体两侧控制区内的核苷酸序列，详细叙述在生产过程中，启动与控制克隆基因在宿主细胞中表达的方法和水平 第十二节 基因工程药物的质量控制 二 培养过程的质量控制 贮存中要求种子纯而稳定 培养过程中，要求质粒稳定 生产发酵中，工程菌表达稳定，能排除外源微生物污染 1 生产用细胞库 基因工程产品的生产采用种子批细胞系统。 需证明种子批不含致癌物质，无细菌、病毒、霉菌和支原体等污染，再由原始种子批建立生产用工作细胞库 在同一个实验室工作区内，不得同时操作两种不同的细胞或菌种，一个工作人员不得同时操作两种细胞或菌种 2 培养过程 培养过程中应测定被表达基因分子的完整性及宿主细胞长期培养后的基因型特征 培养周期结束后，应监测宿主细胞/载体系统的特性：比如：质粒拷贝数、宿主细胞中表达载体残留程度、含插入基因的载体的酶切图谱等 第十二节 基因工程药物的质量控制 三 纯化过程的质量控制 保证提纯分子批次间保持一致、提纯过程中能去除有害物质和热源质 纯化工艺的每一步完成后均应测定收获物纯度，计算提纯倍数、收获率等，要对每一步的纯化效率、活性回收率和蛋白回收率进行检测，只有当这两种回收率呈正相关时，纯化过程才是有效、可行的 四 目标产品的质量控制 基因工程的质量控制主要包括这些：产品的理化性质的鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性和一致性 第十二节 基因工程药物的质量控制 1 生物活性的测定 多肽或蛋白质药物的生物活性是蛋白质药物的重要质量控制指标 生物学效价的测定必须采用国际上通用的方法 采用在动物体内或通过细胞培养进行体外效价测定 重组蛋白是抗原，具有相应的抗体或单克隆抗体，可采用放射性免疫分析法或酶标法测定其免疫学活性 2 理化性质的测定 采用多种方法对重组技术获得的蛋白质药物产品进行全面的鉴定 特异性鉴别、非特异性鉴别、相对分子质量测定、等电点测定、肽图分析、氨基酸组成分析、部分氨基酸序列分析、蛋白质二硫键分析 3 蛋白质含量的测定 根据蛋白质的物理、化学性质进行测定 Folin-酚法、染色法、双缩尿法、紫外吸收法、HPLC法、凯式定氮法 质量鉴定中常用的方法是： Folin-酚法、染色法 4 蛋白质纯度分析 蛋白质纯度分析方法 SDS等电点聚焦 HPLC 毛细管电泳 5 杂质检测 蛋白类杂质： ①纯化过程中残留的宿主细胞蛋白，可采用免疫学的方法测定 ②目的蛋白发生了某些变化，形成在理化性质上与原蛋白极为相似的蛋白杂质，比如一些目的蛋白的沉淀等 这些目的蛋白的变构体在体内往往会产生抗体， 因此对这类杂质的质量控制也要严格限定 非蛋白类杂质 具有生物学作用的非蛋白类杂质主要有：病毒和细菌等微生物、热原质、内毒素、致敏原及DNA 杂质和污染物 检测方法 杂质 内毒素 鲎（hòu）试剂、家兔热原法