基于“钙信号通路-血脑屏障”偶联的中药脑神经保护有效组分筛选方法分析-中药学-中药药效和毒理专业论文.docxVIP

成都中医药大学博士学位论文 成都中医药大学博士学位论文 摘 要 目的： 选择临床抗脑缺血损伤疗效确切的中药（灯盏细辛、川芎、石菖蒲），研究 其化学组分的脑神经保护作用、钙信号通路调节作用以及透血脑屏障能力，揭示 三者的关联性，探讨建立基于“钙信号通路-血脑屏障”偶联的中药脑神经保护 有效组分筛选新方法的可行性。 方法： 1. 采用MTT法测量药物对原代培养的大鼠大脑皮层神经细胞存活率的影响， 筛选脑神经保护活性组分； 2. 采用激光扫描共聚焦显微镜( LSCM) 技术检测活性组分对谷氨酸、KCl 致体 外培养的皮层神经细胞内钙荧光强度变化的影响，筛选出具有钙信号通路调节作 用的活性组分； 3. 采用大鼠脑微血管内皮细胞、星型胶质细胞共培养技术，建立血脑屏障体 外模型，结合HPLC技术检测活性组分的透血脑屏障程度； 4. 采用线栓法阻塞大脑中动脉（MCA）复制大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模 型，进行整体动物的药效学验证。以行为观察、脑梗死比率、血清中超氧化物歧 化酶（SOD）、丙二醛( MDA) 、谷胱甘肽过氧化物酶( GSH- Px) 、一氧化氮合酶（NOS） 等为指标，评价活性组分对脑缺血的保护作用。 结果： 1. 灯盏细辛注射液、灯盏乙素、咖啡酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、川芎挥发 油、川芎嗪、阿魏酸、石菖蒲挥发油、α- 细辛醚等在一定剂量范围内都能不同 程度促进体外培养的皮层神经细胞存活。 2. 灯盏细辛注射液、3，5-二咖啡酰奎宁酸、川芎挥发油、川芎嗪、阿魏酸 以及石菖蒲挥发油等都能抑制谷氨酸、KCl引起的神经细胞内钙超载。灯盏乙素、 α- 细辛醚只对谷氨酸引起的细胞内钙超载有抑制作用。 项目来源：国家自然科学基金课题“基于钙信号通路的中药脑靶向神经保护有效成分筛选方 法研究”（批准号 1 PAGE PAGE 2 3. 灯盏细辛注射液、3，5-二咖啡酰奎宁酸、川芎挥发油、川芎嗪、石菖蒲 挥发油、α- 细辛醚均可透过BBBM，灯盏乙素不能透过BBBM。其结构修饰物 灯盏乙素乙酯能透血脑屏障，且具有脑神经保护作用和钙信号通路调节作用。 4. 研究表明3，5-二咖啡酰奎宁酸、川芎挥发油可通过增加模型大鼠SOD、 GSH-Px、NOS活性，降低MDA含量，发挥脑缺血保护作用。 5．综合分析表明，灯盏细辛注射液、3，5-二咖啡酰奎宁酸、川芎挥发油、 川芎嗪、石菖蒲挥发油、α- 细辛醚等样品的钙信号通路调节作用与其脑神经保 护作用密切相关，且透血脑屏障能力是影响其发挥抗脑缺血损伤作用的关键因 素。 结论： 本研究结果提示药物的钙信号通路调节作用、透血脑屏障能力及脑神经保护 作用与其抗脑缺血损伤作用之间存在很好的关联性，建立基于“钙信号通路-血 脑屏障”偶联的中药脑神经保护有效组分筛选新方法具有可行性，为治疗脑缺血 创新药物的研制提供了新思路。 关键词：钙信号通路；脑神经保护；血脑屏障；脑缺血；灯盏细辛；川芎；石 菖蒲；有效组分 Abstract Objective：Choose the traditional Chinese medicine(TCM) effectively used to treat cerebral ischemia,and study the neuroprotective effect，regulation of calcium signal pathway and blood-brain barrier （BBB）permeability of the ingredients from TCM, reveal the feasibility to establish a screening method of cerebral nerves protective composition based on“calcium signal pathway - blood brain barrier”. Methods： To cultivate rat cerebral cortical neurons cell in vitro and determine the survival rate by MTT, the neuroprotection active ingredients were screened. To establish the model of rat cortical neurons cell injury caused by glutamate and KCl，the change of fluorescence intensity detected by Laser Scanning Confocal Microscopy(LS