华南地区水禽中h5n1流感病毒基因型进化分析-免疫学专业论文.docxVIP

汕头大学医学院硕士学位论文 汕头大学医学院硕士学位论文 PAGE 10 PAGE 10 万方数据 华南地区水禽中 H5N1 流感病毒基因型进化分析 研究生：王嘉 导 师：李康生 摘要 背景与目的 1997 年， H5N1 亚 型 禽 流 感 首 次 在 香 港 爆 发 ， 家 禽 死 亡 率 高 达 75%-100%。令人关注的是，这次禽流感的爆发不仅影响家禽，更导致了 18 例临床感染，其中 6 例死亡，这是首次禽类流感病毒直接感染人类事件。此 后，在 2001 及 2002 年，香港地区又有两次高致病性 H5N1 亚型感染禽类导 致家禽死亡的报道。2003 年初，香港两名患者确诊为 H5N1 病毒感染，1 人 死亡。2003 年末至 2004 年初，H5N1 流感病毒肆虐东南亚。这次爆发流行 波及 9 个国家和地区，更有多人感染甚至死亡，其影响面之大为近二十年来 所未见。H5N1 是否会成为下一次流行性感冒的世界性流行株成为人们关注 的焦点。追溯以往三次感染人类的流感大流行，华南地区都是其中不可或缺 的一环，许多从事流感病毒研究的科学家认为：华南地区在流感病毒进化演 变过程中扮演着重要的角色。此外，香港禽鸟市场上供应的家禽大部分也来 自于华南地区，因此，对华南地区的 H5N1 亚型流感病毒进化进行研究有助 于揭示高致病性 H5N1 的形成及其演变趋势，对该亚型流感病毒爆发进行预 测并为疫苗的研制提供支持。自从 1997 年，香港采取屠宰所有家禽的措施 以防止疫情进一步蔓延后，与引起爆发的 H5N1（A/Hong Kong/156/97）相 同基因组合的病毒未再在香港重现。事件至今已经 7 年， 在华南地区，H5N1 发生了怎样的变化？通过在天然基因储存库——水禽中的自由基因组合，产 生了哪些新的基因型？这些基因型与 A/Hong Kong/156/97 是否相同？对人 类有没有危险性？各种基因型的流行情况如何？以上种种问题尚待解答。对 华南地区水禽中的 H5N1 流感病毒进行分析将有助于了解我国流感病毒进化 的现状，为流感流行的预测打下基础。 材料和方法： 在华南地区四个监测点（云南大理、湖南洞庭湖、江西鄱阳湖、广东汕 头）采集的标本常规处理后，接种于9-11日龄鸡胚尿囊腔，35℃恒温培养72 小时，收取鸡胚尿囊液。血凝阳性（AD≥16）且细菌培养阴性标本进一步做 血凝抑制试验（Hemagglutinin Inhibition Test, HI实验）和神经氨酸酶 抑制试验（Neuraminidase Inhibition Test, NI实验）以鉴定亚型，标本 保存于-70℃冰箱。从中选取27株H5N1病毒代表株进行下一步的分子生物学 工作。用Qiagen的RNeasy RNA试剂盒提取病毒RNA后，逆转录合成cDNA。 以 之为模板，用针对不同基因片段设计的特异性引物，进行PCR反应扩增。以 PCR纯化试剂盒纯化PCR产物，然后进行测序反应。测序在在DNA测序仪 （ABI377）上进行。用GCG 10.2编辑和处理基因序列。用PAUP 4.1进行进化 树分析。在Mega 2.1和Bioedit 5.0.9上进行序列比较和同源性分析。 结果： 1、华南地区水禽中存在多种亚型流感病毒，包括 H5N1；冬春季是 H5N1 亚型流感病毒流行高峰期；近两年来，H5N1 的分离率呈急剧上升趋 势。 2、抗原学分析结果表明，根据标本采集时间及基因型的不同，与单克 隆抗体反应时，华南地区 H5N1 的抗原性可分为高反应组和低反应组； 目前流行的优势基因型（Z 型）的抗原性与以往病毒株相比发生了很 大的改变。 3、进化树分析表明，目前华南地区的 H5N1 流感病毒的 HA 基因仍来源 于 A/Goose/GuangDong/1/96 (H5N1)（简称 Gs/GD）, 属欧亚系列； 这些 H5N1 在水禽中与多种亚型流感病毒进行基因重配，形成多种基 因型，其中 Z 型自 2002 年末开始稳定下来并占主导地位。 4、 基因分析表明， Dk/ST/195/01 的 8 个基因都与 Gs/GD 高度同源， 很可能是它的后裔。此外，由于它的 NA 柄部（stalk region）有 20 个氨基酸的缺失，根据这一发现可重新探讨 HK/156/9（简称 H5N1/97 样病毒）基因型的形成。 5、 基因突变分析显示：M 基因在各基因型的进化中发挥一定作用。在 M2 氨基酸序列上，S64A 和 E66A 的氨基酸突变使得该基因获得对环 境的适应性。 结论： 1、 H5N1 流感病毒在华南地区水禽中长期广泛存在并与多种其它亚 型流感病毒共存，这种适宜的外环境为 H5N1 的进一步发展、进 化提供了条件； 2、 目前在华南地区流 行的 H5N1