课题2多聚英酶链式反应扩增dna片段.pptVIP

在80～100℃的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性；当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链，这个过程称为复性。 难点解析： DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。 * * 课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片断 多聚酶链式反应(PCR技术)， 是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为DNA体外扩增技术。 ★分子生物学研究中最强大的实验技术之一 ★其本质是在体外模拟胞内DNA分子复制的过程 美国科学家　穆利斯(K.B.Mullis) 发明了PCR技术　1993年诺贝尔奖 （一）DNA分子的组成和结构 1、基本组成单位是 .共有 种,每个基本单位是由一分子的 、一分子的 、和一分子的 构成。 脱氧核甘酸 4 磷酸 碱基 脱氧核糖 一 、基础知识 1’ 2‘ 3’ 4‘ 5’ O O P O HO 碱基 O OH O O P O HO OH 碱基 5’ 3’ 3’ 5’ 碱基 脱氧核糖 磷酸基团 碱基 脱氧核糖 碱基 脱氧核糖 5’ 3’ 脱氧核苷酸链结构简图 2、DNA分子的平面结构 A T G C A G C T 氢键 5端 3端 5端 3端 识别 DNA分子的3端与5端 -OH端为3′ ; 磷酸基团的末端为5′。 当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后， DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。 DNA聚合酶不能从头合成DNA，只能从DNA的3′端开始延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物。 5′ 3′ 5′ 3′ （二）DNA的复制 参与的组分 在DNA复制中的作用 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物 总结：胞内DNA复制的基本体系 打开DNA双链 提供DNA复制的模板 合成子链的原料 催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 （三）PCR（多聚酶链式反应） 1、 DNA 分子的热变性原理： DNA双链 单链 变性（加热80-100℃ ） 复性（缓慢冷却） 变性的目的： 复性的目的： 解开双链 有利于引物Ⅰ和引物Ⅱ与两条单链的结合 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） 适温延伸 高温变性 低温复性 重复1~3步30轮 3、DNA复制的方向 DNA的合成方向总是从子链的5’端向3’端延伸 2、步骤：变性 ——复性——延伸 PCR技术的原理总结 利用DNA分子的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解旋与结合，从而完成体外DNA分子的扩增。 体外DNA复制的条件： 四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）、引物、 模板； 缓冲溶液和严格控制温度的温控设备。 复制的方向：子链的5’端向 3’端延伸。 5’ 3’ (a) 第一轮 引物2 5’ 3’ 引物1 3’ 5’ 3’ 5’ 引物2互补链 5’ 3’ 引物1互补链 (b) 第二轮 变性 新引物 新延伸 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ (c) 第三轮 以第二轮产物为模板，重复第二轮过程。 55℃复性 4、前三次循环图解 95℃变性 72℃延伸 5’ 3’ 引物1 引物2互补链 引物2 引物1互补链 引物1 引物2 第一次 第二次 第三次 第四次 引物2互补链 目的片段 （不同长度的链未示出） 5、循环特点： ①上一次循环的产物为下一循环的模板 ②结果含有最初母链的DNA只有两条 ③其它子代DNA分子都为双引物分子式 ④处于两引物之间的DNA序列呈指数增长a×2n 6.PCR的重要应用： 广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等。 7、体内DNA复制与PCR的技术区别： 体内复制 PCR技术 解旋 在解旋酶作用下，细胞提供ATP，部分解开 加热到94oC,双链全部解开，不需解旋酶 引物 一小段RNA 一般用DNA片段 DNA聚合酶 细胞自身的DNA聚合酶 TaqDNA聚合酶 复制特点 半保留复制，边解旋边复制。 复制整个DNA 半保留复制，完全解旋后复制。复制两引物之间的DNA序列 复制的方向 子链的5’端向 3’端延伸 子链的5’端向 3’端延伸 二、 PCR反应的实验操作 1、PCR仪 （一）设备及用具 2、微量离心管 一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml 3、微量移液器 用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次 实质上一台能够自