片段的平序列测定.pptVIP

实验四 DNA片段的序列测定 实验目的 了解Maxam-Gilbert 化学降解法基本原理 掌握Sanger双脱氧终止法的原理 学习测定重组质粒中外源DNA片段序列的基本原理和技术方法 学习使用毛细管序列测定仪进行DNA序列测定的方法 实验原理 DNA电泳 聚丙烯酰胺凝胶 琼脂糖凝胶 Maxam-Gilbert 化学降解法 Sanger 酶学法（双脱氧链终止法） 实验原理 Maxam-Gilbert 化学降解法 1977年， A.M. Maxam 和 W. Gilbert 首先建立了 DNA 片段序列的测定方法。 将DNA 片段的 5‘端磷酸基作放射性标记，再分别采用不同的化学方法修饰和裂解特定碱基，从而产生一系列长度不一而 5 端被标记的 DNA 片段，这些以特定碱基结尾的片段群通过凝胶电泳分离，再经放射线自显影，确定各片段末端碱基，从而得出目的 DNA 的碱基序列。 多聚酶链式反应(polymerase chain reaction) 简称PCR技术 体外扩增特异DNA片段 操作简便，短时间, 数百万个特异的目的DNA序列的拷贝 PCR反应成分 模板DNA(template) 引物(primer) 脱氧核苷酸(dNTP) DNA聚合酶(Taq) PCR反应步骤 变性（denaturation） 退火（annealing） 延伸（extension ） 实验原理 Sanger 双脱氧链终止法 引入了双脱氧核苷三磷酸（2’,3’-ddNTP）作为链终止剂 2’,3’-ddNTP与普通的dNTP不同之处在于前者的脱氧核糖的3’位又少了个羟基。它可以在DNA聚合酶的作用下和多核苷酸链的3’羟基形成磷酸二酯键，但却不能再与下一个核苷酸缩合，结果使得多核苷酸链的延伸终止。 在DNA的合成反应中，除了加入4种正常的dNTP外，再加入一种少量的ddNTP，反应产物是一系列的长短不一的核苷酸链。在4组独立的DNA合成反应中，分别加入4种不同的ddNTP，结果将生成4组核苷酸链，它们将分别终止于每一个A，每一个G，每一个C，每一个T的位置上。对这4组核苷酸链进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，就可读出序列。 毛细管自动测序仪 测序仪的重大改进 荧光染料代替了放射性核素 聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作自动化 应用计算机软件对测序结果进行收集和分析，测序之后可以直接从机器上读出目的片段的序列。 从每次一个样品（单毛细管）到96个或384个样品（多组毛细管） 精确、规模、快速 毛细管自动测序仪 同手工测序一样，DNA聚合酶延伸反应结束后，样品经简单变性处理就可以在测序凝胶中开始电泳。 荧光自动测序系统是以４种荧光素分别标记４种ddNTP，PCR延伸反应后产生的是4组由不同双脱氧核苷酸终止的DNA片段，这四种荧光染料在激光激发下发出不同波长的荧光，因而每一种荧光代表一种碱基，这使得它们都具有“特征的颜色”。 当不同荧光标记的DNA片段电泳经过检测窗口时，被激光激发出不同波长的光线，CCD相机记录结果，可对多个样品同时检测。 MegaBACE 毛细管自动测序仪 实验设备 PCR仪 Megabase毛细管自动测序仪 离心机 实验试剂 测序反应试剂（DYEnamic ET Dye Terminator Cycle Sequencing Kit） 酶、dNTP、ddNTP混合物 Loading buffer（70% formamide,1 mM EDTA) 测序反应缓冲液 测序胶 　　　　　　　　 无菌水 测序引物：根据T-载体上的引物序列合成 7.5 mol/L NH4AC 无水乙醇 75%乙醇 实验步骤 测序PCR反应 反应体系 　　　　　 H2O up till 10.0 μL 10×buffer 0.9 μL DNA 200ng-1μg primer(5μM ) 1.0μL 酶、dNTP 、ddNTP混合物 0.4 μL 反应条件 95℃ 20sec 50℃ 20sec 60℃ 1min30sec 　　 30个循环 实验步骤 测序PCR反应后处理（纯化、浓缩、缓冲液置换） PCR产物中加入1μL的4 mol/L NH4AC ，混匀