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第五章 体外放射分析技术 In Vitro Radioassay 定义与分类 一、体外放射分析技术：在体外实验条件下，以特异性结合反应为生物学基础，以结合反应动力学规律为共同方法学基础，利用核射线对体内的各种生物活性物质进行体外定量分析的各种方法。 二、分类： 1、竞争性体外放射分析法（如RIA） 2、非竞争性体外放射分析法（如IRMA） 3、由体外放射分析技术派生出来的非放射性标记免疫分析技术（酶、化学发光、时间分辨荧光分析） 第一节 放射免疫分析法radioimmunoassay， RIA 1959年，美国的两位科学家Berson和Yalow首次将示踪技术的高度灵敏性和免疫学抗原-抗体结合的高度特异性结合起来，创立了放射免疫分析技术，开创了生物活性物质微量测定技术的新时代。RIA 的特点：灵敏度高、特异性强、准确度高、稳定性好。经不断改进，现在广泛应用于临床检测和科学研究的很多领域。 一、基本原理 竞争性抑制 被测量的微量物质Ag（未标记抗原）和标记有放射性核素的该种物质*Ag(标记抗原)对其抗体Ab有相同的结合能力，反应时， Ag和 一定量的*Ag竞争有限量的Ab。生成的*AgAb的量随Ag的增加而减少，呈负相关关系。 反应达到平衡后，分离*AgAb （B）与*Ag（F），B、F或B/F与Ag的量呈函数关系，利用这一函数关系求出待测抗原的的浓度。 反应式 具体方法 用一系列浓度已知的标准抗原（浓度递增的标准品）在严格相同的条件下与一定量的*Ag和有限量的Ab共同反应，反应达到平衡后，分离B与F，测定B的放射性做为纵坐标，以每一反应管的标准品浓度为横坐标，绘成标准曲线。根据被测抗原试管中的B的CPM值在标准曲线上求出该抗原的浓度 函数式 标准曲线 得到的标准曲线之所以是曲线而不是直线，这是可逆反应的质量作用定律决定的。函数式见上图 根据放射免疫分析法的基本原理，建立放射免疫分析必须具备以下技术条件： 1、可靠的标准品 2、高比活度的标记品 3、高亲和力的抗体 4、合适的分离技术 5、理想的曲线拟合方式 二、基本方法 （一）基本试剂 放射免疫分析反应需要三种基本试剂： 1、标准品（非标记标准抗原） 2、标记抗原 3、抗体 1、标准品 标准品是样品定量的基础，它的质和量的变化直接影响待测样品的测定值。 对标准品的要求如下： 1）标准品和待测样品应属于同一种物质； 2）在与抗体反应时，标准品和待测样品应有相同的活性和亲和能力； 3）高度纯化，不含有影响分析的杂质； 4）对标准品的定量一定要精确 2、标记抗原 标记抗原是样品测量的基础 对标记抗原的要求是： 1）比活度和放射化学纯度必须足够高——以保证分析的灵敏度 标记抗原的放化纯必须不小于95% 2）放射性核素的半衰期合适 3）标记抗原的生理活性未改变 4）标记抗原的应有较高的稳定性 3、抗体 在放射免疫分析中，抗体质量的好坏是影响放射免疫分析的关键因素之一。 高质量的抗体必须具备三个条件： 高亲和力、高特异性、高滴度 1）高亲和力 只有高亲和力的抗体才能得到斜率高的标准曲线，而斜率高的标准曲线是高灵敏度和高精密度的必备条件。亲和力测定方法最常用的是Scatchard作图法（P36） KA值越大（即直线斜率越大），抗体的亲和力越大方法的灵敏度和精密度越高 2）高特异性 抗体必须与反应系统中抗原以外的物质尤其是抗原类似物结合得少，以免影响分析结果 抗体特异性的测定： 方法：测抗体的交叉反应率 交叉反应率越小，抗体的特异性越高 3）高滴度 滴度 是抗体实际应用时的稀释倍数 抗体的滴度越高，其中的干扰物质的影响就越小。 滴度的测定：以一定浓度的*Ag与稀释度不同的抗体进行反应，当*Ag的结合率为50%时对应的抗体的稀释度即为该抗体的滴度。这时的抗体浓度就是实际使用时的浓度。 （二）分离技术 1、聚乙二醇（PEG）沉淀法 2、双抗体沉淀法 3、双抗体+PEG法 4、葡萄球菌A蛋白（SPA）沉淀法 5、活性炭吸附法：葡聚糖包被的活性炭 6、微孔滤膜过滤法：玻璃或醋酸纤维滤膜 7、磁化分离技术：氧化铁-活性炭（-抗体） 8、固相分离技术： 1）第一抗体与试管联接 2）第二抗体与试管联接 （三）数据处理 1、logit-log模型 2、四参数logistic模型： 3、四参数质量作用定律模型 U={（A-D）/[1+（X/C）B]}+D 其中U为各试验管结合率（含NSB） A、B、C、 D分别为0剂量时的结合率， logit-log函数的斜 率，各点实际结合率下降一半时X的量，NSB。 三、质量控制