时间分辨荧光技理术trfia技术培训资料.ppt

广州医学院免疫检验教研室 冯健明 讲师 标记免疫技术的检测水平 放射免疫 （精度：10-12mol/L ） 酶联免疫 （精度：10-9 mol/L ） 化学发光 （精度：10-15mol/L ） 电化学发光 （精度：10-17mol/L ） 时间分辨荧光（精度：10-18mol/L ） 放射性免疫分析法（RIA） 应 用 放免自60年代问世以来对临床诊断起了革命性的贡献，是一项较为成熟的诊断技术。 夹心法、竞争法的标记原理为以后的检测技术的发展奠定了基础。 问 题 放射性（125 I），对环境的污染及对身体的危害 125 I 的半衰期短而导致其试剂有效期短 被标记物的稳定性差 操作繁琐，费时 无法保存备用 酶免疫分析法（ELISA） 应 用 酶免的最大优势在于避免了对环境和人体危害 试剂有效期较长 曾经一度被认为是取代放免的检测手段 问 题 灵敏度、重复性不及放免，易造成漏检和假阳性 因酶的纯度和反应过程容易受环境因素影响，导致稳定性不好 化学发光免疫分析法（chemiluminescent immunoassay） 应 用 单个样本检测速度快，适合做急诊 灵敏度较高 自动化程度高 分类： 以丫啶酯直接标记 以HRP标记，鲁米诺为发光底物—Amerlite系统 以AP(碱性磷酸酶 )为标记物，AMPPD为发光底物 问 题 样品不能重复检测 本底较高 仪器故障率较高 试剂稳定性较差 检测精度不高，在超微量分析及早期诊断方面能力不足 非开放性试剂；试剂价格高 电化学发光免疫分析法（ECL） 应 用 80年代末期问世的新型化学发光免疫分析方法 基本原理：根据三联吡啶钌[Ru(bpy)3]和三丙胺在电场触发下产生发光的化学发光反应 本底较小、灵敏度较高、线性范围较宽 以罗氏为代表 缺 点 非开放性试剂系统、不能做科研 试剂价格过高 二、时间分辨荧光技术  （Time-Resolved Fluorescence） 时间分辨荧光发展史 时间分辨免疫荧光技术的定义 用三价稀土离子及其螯合物作为示踪物，标记抗原、抗体、激素、核酸探针等物质 当反应体系发生后，如抗原抗体免疫反应、核酸探针杂交等反应，经解离—增强作用，用时间分辨荧光仪，测定最后产物的荧光强度 根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的 TRF分析原理图（1） 标记物为稀土金属---镧系元素 标记物为稀土金属---镧系元素 2、Stokes位移大（大约290nm） 铕：激发光340nm、发射光613nm 荧光素的Stokes位移为280nm 3、荧光特异性强（发射光谱带很窄：615± 5nm） 4、解离-增强技术可使其荧光性提高100万倍 巨大Stokes位移 TRFIA为临床检测带来的先进性 灵敏度更高，检测范围更广 以下数据均出自于各制造厂家自己的产品说明书 试剂 DELFIA（WALLC） Immulite（DPC化学发光） ACS-180(拜尔） AFP 0.1-1000IU/ml 0.2-300IU/ml 1.0-1000IU/ml CEA 0.1-500ng/ml 0.2-500ng/ml 0.5-100ng/ml HCG 0.5-10000U/L 5-5000U/L 2-1000U/L TSH 0.005-100μU/ml 0.002-75μU/ml 0.03-150μU/ml FSH 0.05-256mU/ml 0.1-170mU/ml 0.3-200mU/ml Prog 0.08-120nmol/L 无 0.1-40ng/ml Prolactin 0.04-250ng/ml 0.5-150ng/ml 0.3-200ng/ml 　 标准曲线稳定，试剂保质期时间长 时间分辨荧光与化学发光方法学比较 时间分辨荧光 　　化学发光 发光效率 95% 1% 重复检测 可无数次 　　 不可重复 本底噪声 零本底 干扰大 灵敏级数 10-18 10-15 标记物 原子 大分子化合物 标记位点