人视黄醇结合蛋白4在杆状病毒系统中的表达及其多克隆抗体制备.PDFVIP

974 任玉莹 等/人视黄醇结合蛋白4 在杆状病毒系统中的表达及其多克隆抗体制备 生 物 工 程 学 报 Chinese Journal of Biotechnology July 25, 2013, 29(7): 974−985 /cjbcn ©2013 Chin J Biotech, All rights reserved 医学与免疫生物技术 人视黄醇结合蛋白4 在杆状病毒系统中的表达及其 多克隆抗体制备 任玉莹，陈丹，郭玉争，史洪娜，刘娟，班靖洋，刘亚宁，吴晓芳，王维龙，程海， 李鼎锋，刘勇，王立良 北京安百胜生物科技有限公司，北京 100176 任玉莹, 陈丹, 郭玉争, 等. 人视黄醇结合蛋白4 在杆状病毒系统中的表达及其多克隆抗体制备. 生物工程学报, 2013, 29(7): 974−985. Ren YY, Chen D, Guo YZ, et al. Expression of human retinol-binding protein 4 in insect baculovirus system and preparation of its polyclonal antibody. Chin J Biotech, 2013, 29(7): 974−985. 摘 要: 旨在利用杆状病毒系统表达、制备人视黄醇结合蛋白 (RBP4) 并检测其免疫原性。将人 RBP4 基因片 段及信号肽 SS64 片段亚克隆到杆状病毒转移载体 pFastBac-dual (pFBd) 中，获得相应的重组转移质粒；转化大 肠杆菌菌株 DH10bac ，转座后经筛选获得重组穿梭质粒 rbacmid ，将重组穿梭质粒转染孔板培养的 Sf9 细胞， 获得含人 RBP4 表达框的重组杆状病毒，经过扩增获得毒种。毒种感染对数生长期的 Sf9 细胞并表达人 RBP4 蛋白 (I-RBP4) ，通过 SDS和 Western blotting 对表达蛋白进行检测和鉴定。用毒种感染悬浮培养的 Sf9 细胞制备一批 RBP4 蛋白，完成 SDS 、Western blotting 的检测及少量的多抗制备。纯化重组蛋白并与 E.coli 重 组人 RBP4 (E-RBP4) 分别免疫家兔。实验结果，酶切鉴定及测序证实重组转移质粒构建正确；成功构建重组 RBP4-bacmid ；人 RBP4 蛋白在昆虫细胞获得高效表达。表达的 RBP4 蛋白可以分泌到培养基中，分子量约为 23 kDa ，经过计算表达量为 100 mg/L；纯化蛋白免疫兔子制备了多抗血清，血清滴度为 1 ∶100 000，高于原 核表达的抗体滴度 (1 ∶10 000)，与人体提纯蛋白制备的抗体滴度相近。杆状病毒系统高效表达了人的 RBP4 蛋白，具有较好的抗原性，并获得高亲和力的抗血清，为下一步的人血 RBP4 检测试剂盒的制备打下了坚实的 基础。 关键词: 视黄醇结合蛋 4 (RBP4) ，杆状病毒表达系统，基因表达，蛋白纯化，多抗制备 Received: November 5, 2012; Accepted: March 29, 2013 Corresponding author: Liliang Wang. Tel: +86-10 E-mail: wangll@ 网络出版时间：2013-06-25 网络出版地址：/kcms/detail/11.1998.Q1617.001.html 任玉莹 等/人视黄醇结合蛋白4 在杆状病毒系统中的表达及其多克隆抗体制备 97