第七章哺结乳动物胚胎干细胞技术.pptVIP

常规培养法 未去透明带的胚泡培养3－4天，ICM细胞团从贴壁胚泡内长出来； 胰蛋白酶和EDTA混合消化液在37℃消化5min； 解离的细胞团移至滋养层的24孔培养板，继续培养4天，可在一些孔内见到巢状胚胎干细胞团； 胰蛋白酶消化巢状胚胎干细胞团并继续培养，克隆和纯化ES细胞。 视ES细胞巢密度转移到较大容积的培养皿或培养瓶。 五.ES细胞的保存 1.常规保存：通过不断的更换分化抑制培养液，以传代培养方式维持ES的不分化状态。如人的ES细胞在体外培养传代2年仍维持不分化状态。 2.冷冻保存：通过超低温冷冻保存使细胞的代谢活动完全停止，达到长期保存的目的。 六.ES细胞的鉴定 通过分离培养获得的ICM或PGCs细胞在传到8~12代时，需要通过生化或细胞生物学指标的鉴定最终确认为ES细胞系。 1.形态：呈克隆状生长，即单个ES细胞能繁殖呈形态、功能和遗传基础完全相同的一簇细胞，并凝聚成团，外观形似鸟巢。 2.阶段特异性胚胎抗原(SSEA)：对细胞表面的SSEA通过化学方法检测，先将细胞用多聚甲醛固定，在用生物素标记的二抗和辣根过氧化物的底物处理，来鉴定细胞表面的特异性糖蛋白。 3.端粒酶检测：通常ES细胞端粒酶水平远高于其他分化的体细胞，可用正常体细胞或癌细胞做对照，用专用试剂盒检测。 4.Apase（碱性磷酸酶）：可通过组织化学方法鉴定，细胞经乙醇或病痛甲醛固定后，直接加入底物