双链DNA诱导细胞STING蛋白降解及调节机制研究-病原生物学专业论文.docxVIP

中文摘要干扰素基因刺激蛋白(Stimulator 中文摘要 干扰素基因刺激蛋白(Stimulator of interferon gene，STING)是双链DNA (double．stranded DNA，dsDNA)诱导机体产生天然免疫反应的重要信号转导蛋白， 在dsDNA的刺激下，STING可介导细胞产生I型干扰素(Interferon，IFN)、白介 素6(Interleukin 6，IL．6)及IL．1D等细胞因子，从而使细胞发挥抗病毒、抗细菌的 作用。作为重要的信号转导蛋白，STING蛋白水平的高低直接影响天然免疫反应强 度，研究STING蛋白水平调节机制对于有效调节天然免疫反应强度具有重要意义。 以往研究发现，多种细胞分子机制可通过泛素化蛋白酶体降解方式调节STING蛋 白水平，进而影响其介导天然免疫反应的强度。在此基础上，我们试图进一步研究 STING蛋白的调节机制，该工作也可为进一步丰富DNA天然免疫信号通路提供数 据。 在本研究中，我们发现质粒DNA转染可诱导MRC．5细胞中STING蛋白表达 水平降低，表现出明显的时间效应和剂量效应。另外，除了质粒DNA以外，其他 dsDNA，如PCR扩增的dsDNA片段、人基因组DNA、不同的病毒基因组DNA都 可诱导STING蛋白水平的降低，说明STING蛋白水平下降是dsDNA转染的一个 普遍现象。不同长度DNA片段检测结果显示，短于1000bp的DNA片段不能诱导 STING蛋白水平的降低。 为研究STING蛋白降解的生物学效应，我们对STING蛋白与维甲酸诱导基因 I(Retinoic acid inducible gene I，RIG．I)、IL．6以及IFN．13之间的关系进行研究。首先， 研究下调STING蛋白水平对这三个分子表达水平的影响。利用STING特异性的 siRNA(siSTING)下调STING蛋白水平可显著降低RIG．I的表达，首次发现RIG．I 除了可作为RNA或DNA感受器外，还可作为STING蛋白激活的下游分子。与已 有研究结果相同，下调STING蛋白水平可降低IL．6和IFN．13的表达，以上研究表 明这三个分子都是STING激活的下游分子。其次研究RIG．I、IL．6和IFN．13是否参 与调节STING蛋白的降解，结果发现：1)利用RIG．I特异性的siRNA(siRIG．11下 调RIG．I表达，可部分提高STING蛋白水平，首次发现RIG．I可反向诱导STING 蛋白的降解：2)利用IL．6抗体处理细胞，阻断IL．6的功能，可使STING蛋白水 平略有上升，提示IL．6也在一定程度上参与STING蛋白的降解；3)外源加入IFN．13 不能降低STING蛋白水平，提示IFN．D本身可能不参与调节STING蛋白的降解。 最后研究RIG—I、IL．6和IFN．13之间以及与STING蛋白的相互关系，结果发现外源 加入IFN一13可显著提高RIG．I的表达，提示RIG．I和IFN．D是同一信号通路上的两个 分子，RIG-I是IFN．p激活的下游分子。单独加入IFN．p可诱导RIG．I表达，但不能 诱导STING蛋白的降解，说明RIG．I单个分子不能启动STING蛋白的降解。同时， 万方数据 siRiG．I与IL．6抗体共同作用可进一步抑制STING蛋白的降解，提示RIG．I与IL．6 siRiG．I与IL．6抗体共同作用可进一步抑制STING蛋白的降解，提示RIG．I与IL．6 在诱导STING蛋白降解效应上具有协同作用，也同样说明STING蛋白的降解需要 多个分子共同作用。总之，STING的激活可以明显增强RIG．I、IL．6和IFN．D的产 生，而持续的RIG．I、IL．6以及IFN．D增高又会诱导STING蛋白的降解，说明这是 宿主细胞为了避免过强免疫反应所采取的一种负反馈调控机制。 为研究STING蛋白的降解机制，利用蛋白酶体抑制剂Bortezomib共处理质粒 转染细胞并利用免疫共沉淀法检测发现，STING蛋白的降解依赖于泛素化．蛋白酶 体途径。然而，特异性下调泛素化E3连接酶RNF5的表达，不能抑制STING蛋白 的降解，排除了RNF5作为STING蛋白降解的泛素化E3连接酶的可能。在泛素化 位点研究上，诱导突变STING蛋白上所有的赖氨酸残基均不能抑制STING蛋白的 降解，说明STING蛋白的降解可能发生了非常规的泛素化修饰。另外，特异性下 调干扰素刺激基因(Interferon stimulated genes，ISG)ISGl5蛋白水平，可进一步 促进STING蛋白的降解，提示蛋白降解同时受到泛素化和ISG化两种修饰的反向 调节。 为验证其他细胞是否也存在STING蛋白降解的负反馈调控机制，对人二倍体 细胞(2