基于dn系a序列的相关技术.pptx

一、PCR原理与操作;基于变性与复性原理的PCR技术;;PCR操作;PCR引物设计的原则;引物序列设计与分析;引物设计案例;PCR反应条件;Taq DNA聚合酶的生物学活性： 70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子 70℃ 60核苷酸/S/酶分子 55℃ 24核苷酸/S/酶分子 高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。;PCR的类型;多重PCR:是指在一个单一反应中同时扩增多个序列的反应过程，能够节省时间和精力。 如基因组扫描等 定量PCR技术是指以外参或内参为标准,通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测,进行PCR起始模板量的定量。 锚定PCR：使用一条锚定引物就一条特异性引物扩增已知一端序列的目的DNA。 ;巢式PCR：利用两套PCR引物对进行两轮PCR扩增反应组成: 在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物 此产物再在内引物的存在下进行第二轮扩增。 差别显示ＰＣＲ：是根据绝大多数真核细胞mRNA3’端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）结构，因此可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸为引物将不同的mRNA反转录成cDNA。 ;定量PCR;Q-PCR荧光染料;Taqman探针;Molecular Beacons（分子信标）;荧光定量PCR的有关参数;初始模板浓度的确定;利用阈值的原因;实时荧光定量PCR技术的应用;二、DNA序列测定;化学法： 1977年Maxam针对四种核苷酸使用不同的链断裂方法。此法简便、精确，对于较短的DNA片段分析起来比双脱氧法快得多，因此目前也被广泛采用。;Maxam-Gilbert 法所用的化学技术;化学法测序实例;末端终止法;双脱氧链末端终止法测序基本原理示意图 ;双脱氧法的技术过程;其他DNA序列测定方法;1、鸟枪法进行DNA序列测定;;DNA芯片测序 基本原理 将各种排列顺序的寡核苷酸点播在芯片上, 每个点播的寡核苷酸在排列的方阵中都有指定的位置.待检测的DNA分子与芯片温浴,凡是能杂交的寡核苷酸都会在确定位置发出信号,然后根据获取的信息将寡核苷酸的顺序进行对比组装,拼接成完全的DNA顺序. ;利用基因芯片进行杂交测序的原理 ;4 序列的组装;;返回; 各重叠群间仍有间隙 顺序间隙 物理间隙 ↓ ↓ ;2、焦磷酸测序;3、454新型序??测定方法;454测序技术;文库构建;带有A-B接头片段分离;Emulsion(乳滴） PCR;大量单链DNA的球珠获取;测序反应;数据分析处理;数据拼接;最后组装;3、1G通量的DNA序列测定技术;;;;4、单分子测序技术;d.DNA杂交测序法(SBH-Sequencing by hybridization) 如果一段较短的DNA探针能与较长的DNA片段杂交，并形成完全的双链结构，我们就推测在靶DNA上存在着相应的互补序列，这就是DNA杂交测序法的基本原理。 将一种12-mer的靶DNA与完全随机合成的8-mer寡核苷酸控针混合杂交，在总数为48=65536种8-mer的控针群体中，仅有5种探针会与靶DNA杂交，形成完全互补的双链分子。;当靶DNA与标记探针形成G-T或G-A末端碱基错配的双链体时，检测有一定难度。寡核苷酸探针越短，碱基错配造成的去稳定效应越明显，较易与完全的双链体分子相区分。但是，探针短，杂交产物的总体稳定性下降，信/噪比下降，影响结果的可靠性。所以，6-mer寡核苷酸矩阵芯片只能用于测定500bp的靶DNA；7-mer=2000bp，8-mer=8000bp。 SBH的应用：① 可有效检测靶DNA中的单碱基突变；② 可用于不同DNA片段之间的序列比较；③ 可用于检测不同生长发育状态下细胞中特定基因的表达状况；④ 可用于检验传统测序技术的准确性。 建立在基因组图谱基础上的”鸟枪法”,即所谓”指导鸟枪法”或”指导测序”。;三、分子杂交;分子杂交的目的;1、原位分子杂交;;膜上原位杂交： 将菌落或噬菌斑印在尼龙膜上；NaOH处理，不仅可以杀死细菌还可以将DNA吸附在膜上，用无关单链DNA（鱼精子DNA）预杂交，将其吸附在空白的区域，减少背景，筛选阳性克隆。 作用：从基因文库中钓基因。;2、斑点杂交;3、Southern杂交;动画图解;4、Northern杂交;5、Western杂交;;基因芯片;6、电镜观察;图 解;第三节：DNA修饰;CpG岛（CpG Island）;DNA甲基化的作用;DNA甲