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微卫星标记在动物基因图谱构建中的应用 1111075015 吴蕾 1.微卫星标记的结构特点 SSR:1~6个碱基的核心序列，串联而成 存在于所有真核生物基因组，随机分布0~150kb就存在一个位点。 于间隔区，内含子，调控区(启动子，增强子) 2.微卫星位点多态性及其遗传 侧翼序列 核心序列:重复单位数,等位基因数 重复单位数相同_纯合 重复单位数不同_杂合 微卫星的遗传遵循孟德尔遗传定律 3.微卫星位点的保守性及其应用 紧密相关的物种具有一定的保守性,如鸡于火鸡,牛与羊 Moore用牛的微卫星引物在羊,马,人基因组扩增 羊:56%的引物出现特异性产物，其中42%表现出多态性 马,人：无 Levin用48个鸡的微卫星引物，于火鸡中：92%扩出产物，33产物经鉴定是与鸡同样的微卫星，28表新出多态性 4.微卫星标记的研究方法 寻找方法1 数据库中,已知物种的微卫星引物，扩增，多态性分析，测序。 可以准确高效地找出微卫星微点，节省费用和时间。但进化，变异，物种间较大差异，不难呢过满足制作基因图谱的需要 利用鸡的引物，以鸵鸟等禽类的基因组为模板扩增，以找到其微卫星标记 NAGRP美国国家动物基因组研究计划拟用此方法对鸭，日本鹌鹑进行研究 4.微卫星标记的研究方法 寻找方法2 构建小插入片段文库，从其中进行筛选（200~600bp） 简单，但获得的微卫星克隆比较少 尽量除去不含重复序列的DNA片段 亲和捕捉 抗生物素蛋白与生物素的亲和，与目标DNA片段进行杂交，使之停留在膜上，然后洗脱获得含有大量微卫星的DNA小插入片段 4.微卫星标记的研究方法 亲和捕捉 1: 获得目的DNA片段 超声波断裂，甲基化处理，连接EcoR1 DNA,酶切，回收300~800bp 2: 亲和捕捉 PCR扩增，热处理产物,与生物素化重复片段进行杂交，混合物与带有抗生物素蛋白的膜或磁珠混合，离心后连续冲洗 冲洗得到的片段大都含有微卫星重复，经PCR扩增，酶切后用常规方法构建文库 4.微卫星标记的研究方法 亲和捕捉阳性克隆比例在50%以上，可富集各类型的微卫星片段 不需要构建原始文库，操作简单，但效率更高。 5.微卫星标记在动物基因图谱构建中的应用 基因图谱，详细了解有价值的数量性状，抗病性状位点的组成与表达调控方式 物理图谱：定位 遗传连锁图谱：找寻多态性标记，进行连锁分析，构建这些标记的连锁群。 连锁群间相互独立，根据标记间的距离和相对位置，绘制成图即标记遗传连锁图谱 表型标记，生化标记，都可用来构建遗传连锁图谱，但分子标记（SSR,RAPD,小卫星），尤其是SSR因多态性高杂合子比例高，以及保守性等特点，已成为主要标记 微卫星构建遗传连锁图的基本想法是：微卫星，每隔一定距离找到一个微卫星标记，当饱和度足够大时（每隔10~20cM，并覆盖90%以上基因组），则可借助微卫星标记找到任何功能基因及QTL。 研究进展 牛: 1994 年Barendse 首次用微卫星标记作牛的遗传连锁图。Bishop 等(1994) 构建的牛遗传连锁图谱中有微卫星标记310 个; Barendse ( 1997) 的中等密度牛基因组连锁图,总计已有746 个标记,其中601 个微卫星标记,连锁图总长度为3532cM ,所有标记的平均距离为5. 3cM 猪 Rohrer 等(1994) 首次利用微卫星标记构建了猪的基因组连锁图谱,共有微卫星标记383 个,连锁图总长度为1997cM ,覆盖了24 个连锁群。 在最近版本图上的微卫星为1042 个,总长度为2286. 2cM ,平均间距为2. 23cM。 微卫星数量多，分不均与广泛，多态性丰富，适于PCR进行自动化检测主要标记 目前微卫星标记在构建基因图谱中的应用主要侧重于两个方面 1:增加微卫星标记数,提高连锁图的密度 2:遗传连锁图与物理图谱的整合