流式细胞术一基本原理.pptxVIP

流式细胞术 ---原理、操作及应用;教学参考书;主要内容;1.1 流式细胞术简介;流式细胞术的特点;流式：单个细胞分析，收集每个细胞的数据，更精准； WB ：群体分析，得到多个细胞的平均值。 ;流式细胞仪的发展及商品化;1979年 国家科委重点项目： 研制国内第一台激光流式细胞仪； 1982年 国内第一台三参数激光流式细胞仪诞生； 1984年 国家科委组织科研成果的鉴定验收； 1985年 获国家卫生部科技成果乙等奖； 1985年--1990年 灵敏度、信噪比、更多参数； 流式分选仪研制开发； 计算机四参数软件； 样品制备、医学生物学应用。 ;流式细胞仪的分类;BD公司分析型流式细胞仪;BD公司分选型流式细胞仪;Beckman Coulter流式细胞仪;1.2 流式细胞仪的结构组成;1.2.1 液流系统;（一）流动室和液流驱动系统;;（二）进样速率控制;1.2.2 光学系统;（二）光束成行系统;FCM的单细胞照明技术：这种椭圆形光斑的检测区保证样本中的细胞是一个一个分别受到最大光照。;（三）光收集系统;;FACSCalibur流式细胞仪信号检测系统;全反射光路;1.2.3 电子系统;（一）光电检测器(photodetector);（二）电信号两种放大方式;（三）电脉冲信号的面积A、高度H和宽度W; 光信号　　电信号　　数字信号;通道(channel) 一个光电检测器就是一个通道，有多少个光电二极管/倍增管，就有多少个通道： 散射光通道: FSC通道和SSC通道； 荧光通道 通道命名方式： 以FL(fluorescence)加数字命名，如FL1、FL2、FL3等。 以该通道接收的主要荧光素命名，如FITC通道、PE通道、APC通道等。 For example：FACSCalibur有488nm和633nm两根激光器，488nm能检测FSC、SSC、FL1(FITC)、 FL2(PE)、 FL3(PerCP)，635能检测FL4(APC)，代表Calibur有6个通道，最多能同时检测4个荧光，6种参数。;1.3 流式细胞术光信号检测;1.3.1 散射光信号;（二）侧向散射光SSC;（三）散射光的作用;;（三）阈值 Threshold;1.3.2 荧光信号;（二）常用荧光素;核酸荧光染料 PI（碘化丙啶 535, 623） 可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用于DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响；PI不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。 7-AAD（7-氨基放线菌素D 545, 647 ） 以插入的方式与DNA链的G-C碱基对结合，不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。 DAPI（4,4,6-二脒基二苯基吲哚 358, 456） 可以非嵌入方式与DNA链上的A-T碱基对特异性结合。变异系数明显小于其他染料，一种理想的DNA定量染料。 Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的方式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞DNA定量分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。 PY（派若宁 560, 573） RNA染料，能进入活细胞。 AO（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光，RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。;其他常用荧光染料;（三）荧光抗体的选择;B 根据抗原表达强弱合理选择抗体 不同的荧光素强度有所不同； 高表达的抗原可用不太“亮”的染料，更“亮”的荧光素分配给表达低的抗原： CD4-FITC、CD25-APC、Foxp3-PE ;1.4 FCM数据存储、显示与分析;FCM数据显示方式;直方图Histogram;横坐标既可以是线性的，也可以是对数的。;散点图;散点图和伪彩图;等高图和密度图;假三维图和三维图;设门与数据分析;矩形;十字门;1.5 流式分选;四路分选原理;液滴延迟;分选指标;分选纯度指被分选出来的细胞所占的百分比，一般能达99%以上。 分选收获率是指被分选出的细胞与原来总细胞的百分比。 分选纯度和收获率永远是相互矛盾的，纯度提高，收获率降低，反之亦然。 富集模式(enrich mode) 纯化模式(purify mode) 单细胞模式(single cell mode);流式分选和磁珠分选;比较项目;二、流式细胞术操作与技巧;;