突变和多态去的分析.pptVIP

常用的基因突变和多态分析技术 基因突变与检测方法的选用 等位基因特异的寡核苷酸探针诊断 当基因的突变部位和性质已完全明了时，可以合成标记32P的等位基因特异的寡核苷酸探针（allele-specific oligonucleotide, ASO）来进行诊断。探针通常为20个碱基左右的核苷酸包括了突变位点在内。用于探测点突变时一般需要合成两种探针，一种与正常基因序列完全一致，能与之稳定地杂交，但不能与正常基因序列杂交；另一种与突变基因序列一致，能与突变基因序列稳定杂交，但不能与正常基因序列稳定杂交。这样，使当地调整杂交条件，使只有探针与待测DNA完全一致时才能稳定地杂交结合。就可以把只有一个碱基发生了突变的基因区别开来。 单链构象多态性诊断法 单链构象多态性（single strand conformation polymorphism, SSCP）是指单链DNA由于碱基序列的不同可引起构象差异。这种差异将是相同或相近长度的单链DNA电泳迁移率不同，从而可用于靶序列DNA中单个碱基的替代、微小的缺失或插入的检测。用SSCP法检测基因的点突变时，通常在疑有突变的DNA片段附近设计一对引物进行PCR扩增，然后将扩增产物用甲酰胺等变性，并在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳。突变所引起的DNA构象差异将表现为电泳带位置的差异，从而可据之作出诊断。 PCR-SSCP法具有能快速、灵敏地检测有无突变或多态性的优点，但如与阐明突变的碱基性质，则需作进一步的序列分析。 * 各种检测突变方法的相对灵明度 0.001% DNA sequence required PCR amplification 0.3-0.5% Labour intensive Interphase chromosomes High quality chromosomes FISH 1% Labour intensive Slow Metaphase chromosomes Cytogenetics 1% Labour intensive Slow Southern blotting 1-5% Lacks Specificity Immunophenotyping 5 % Low Sensitivity Morphology 基因异常 方 法 探针、引物或限制酶 基因缺失 Southern杂交 缺失基因的探针 PCR分析 引物包括缺失或在缺失部位内 点突变 RFLP分析 突变导致其切点消失的限制酶 ASO杂交 正常和异常的ASO探针 PCR分析 引物包括突变部位 （RFLP,SSCP) 基因已知但异常不明 基因内或旁侧序列 基因内或旁侧序列探针或引物 多态性（RFLP,AMP-FLP) 连锁分析 基因未知 与疾病连锁的多态性， 与疾病连锁的多态位点探 如AMP-FLP连锁分析 针或引物 RFLP位点单体型连锁分析 Add radio-labeled normal DNA probes Amplify DNA and hybridize to membranes Allele Specific Oligonucleotide(ASO) Hybridization Add known mutant DNA probes Patients #1 #2 #3 #1 #2 #3 α α α 10kb 4kb ↑BamHⅠ ↑BamHⅠ ↑ ↑ 5′ 3′ 5′ 3′(α) 5′ 3′(--) αα/αα