血清蛋网白质聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳.pptVIP

血清蛋白质聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳 蛋白质的分离 蛋白质是生物大分子化合物，具有胶体性质、沉淀、变性和凝固等特点　蛋白质分离纯化的方法主要有：盐析、透析、超离心、电泳、离子交换层析、分子筛层析等方法。 电泳技术的原理 电泳蛋白质在一定的pH溶液中可带有电荷，成为带电颗粒，在电场中向相反的电极方向泳动。由于蛋白质的分子量和电荷量不同，其在电场中的泳动速率也不同，从而将蛋白质分离成泳动速率快慢不等的条带。 电荷的来源 蛋白质带有可解离的氨基（-NH2）和羧基(-COOH),是典型的两性电解质，在一定PH条件下会解离带上电荷 迁移率 电场力 F=EQ （E：电场强度， Q：电荷) 阻力 F=6πγηυ （γ：半径，η：介质粘度） υ/E表示单位电场强度时粒子运动的速度，称为迁移率 ，也称位泳动度，以μ表示： μ= υ/E=Q/πγη 可见，离子的迁移率在一定条件下取决于粒子本身的性质， 即其所带的电荷和形状。不同的粒子有不同的迁移率，因此 电泳一定时间就可分开它们。 样品性质 与分离样品所带电荷成正比，与样品相对分子质量成反比。 电场强度 电压越高，带点粒子移动越快。 缓冲液的性质 缓冲液的PH值距等电点越远指点所带静电荷越多，迁移速度越快；反之越慢。离子强度等于1/2∑cizi2 支持介质 理想电泳支持介质应是网状结构、不带电荷、对被分离物质无吸附作用的惰性材料。 温度 电泳的分类 1、根据固体支持物种类的不同 纸质电泳 醋酸纤维素薄膜电泳 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 2、根据电泳装置不同 薄膜电泳 垂直板电泳 平板电泳 垂直圆盘电泳 聚丙烯酰氨凝胶电泳 实验目的 1、掌握电泳的基本原理，了解电泳仪、电泳槽的基本结构与功能。 2、熟悉聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本过程。 三大效应 表面积大而薄，便于通冷却水以降低热效应，条带更清晰。 可多个样品的电泳 胶板制作方便，易剥离，样品用量少，分辨率高。 胶版薄而透明，可制成干板，便于长期保存与扫描。 可进行双向电泳。血清蛋白在醋酸纤维素薄膜电泳中，只可以分离出5~6条区带，而在聚丙烯酰胺凝胶电泳中可分离出数十条区带。 实验器材与试剂 器材 圆盘电泳槽、电泳仪、脱色摇床、染缸、微量加样器、注射器、小烧杯 试剂（缓冲液PH值准确配置后用PH计调试） 实验操作 凝胶柱的准备 装柱 将凝胶管插入电泳槽槽底橡胶塞孔中，加入电极缓冲液与下电泳槽，随后放入凝胶管及上槽，除气泡(上电极槽以电极和凝胶管完全浸入为宜，下电极槽以凝胶管浸入3/5为宜) 加样 取血清12μL ，7号试剂12μL混匀，品均加入4管，每管6μL.（加样枪不可插入过深，以免刺破凝胶，同时要缓慢、均匀，以免搅动缓冲液引起样品扩散。） 电泳 接通电源，上负下正，先调节电流1mA/管，待示踪染料进入分离胶后调节为2~3 mA/管，待示踪染料离管下口0.5cm时切断电源。 剥胶 注入蒸馏水做润滑剂，针头螺旋式前进，缓缓剥离。 固定、染色及漂洗 将凝胶柱浸入8号剂中泡10min，进行固定，用9号剂染色10min，用清水冲洗，放入10号剂中漂洗脱色。 结果示意图 注意事项： 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒性试剂，对皮肤有刺激作用，注意避免直接接触 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺溶液应装在棕色瓶中，用前检测pH值是否失效。失效液不能聚合。 加速剂（TEMED）要密封保存，过硫酸溶液现配现用，防止氧化失效。 配好胶后应尽快灌胶（不要形成气泡） 切记装柱后应用蒸馏水密封 灌胶和电泳时要注意排气泡 加样时不能损伤凝胶表面 电泳时凝胶管不能漏水，并且与电泳池垂直 固体胶切忌倒入水池 The end! 谢谢！ * * 第六组 透析 超速离心 凝胶过滤层析 离子交换层析 COO- COO- COOH ╱ + H+ ╱ + H+ ╱ Pr ←————→ Pr ←————→ Pr ╲ + OH- ╲ + OH- ╲ NH2 NH3+ NH3+ PHPI PH=PI PHPI 影响电泳分离效果的因素 醋酸纤维素薄膜电泳 醋酸纤维素薄膜电泳