植物同工酶凝胶电泳实验.doc

植物同工酶凝胶电泳实验 ? 一、实验目的和意义 同功酶专指受遗传体系决定的酶的不同分子形式。从作用上看，分子形式不同的酶能做一样的工作，即催化同样的生化反应，所以把同功酶改称为同工酶。由于蛋白质分子的结构归根结底是由基因的DNA分子结构决定的，因此，同工酶就成为鉴定生物基因型是否有差别的可靠指标，在遗传育种，生长发育，物种起源，生理卫生等领域的研究中成为一种重要的工具；此外，同工酶还与植物抗性有一定联系，可用来鉴定抗性的强弱。 本实验的实验目的主要是让学生掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳分析植物同工酶的原理及方法、步骤。提高学生的实际操作及动手能力。培养学生对实验结果的分析能力。 二、实验原理 带电粒子在电场中向带有相反电荷的电极移动，叫做电泳。在一定的pH条件下，每一种分子都具有一定的电荷、大小与形状，在相同的电场经一定时间的电泳，便会集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。不同组分的蛋白质（包括同工酶）分子组成、结构、大小、形状均有所不同，在溶液中所带的电荷多寡不同，在电场中的运动速度也不同。因此经过电泳便会分成不同的区带。然后用适当的染料着色，这样就可以在凝胶上展现出蛋白质或同工酶的谱带。 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作支持介质的一种电泳方法。它是由丙烯酰胺单体（Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下，聚合交联而成的三维网状结构凝胶。当Acr和Bis遇到自由基时，便能聚合。Acr和Bis的浓度、交联度可以决定凝胶的密度、粘度、弹性、机械强度以及孔径大小。 三、材料 新旧小麦种子、锦带花上下枝叶片 四、实验器材与试剂 1.器材：电泳仪一套（稳压电源，垂直电泳槽和凹槽玻璃）；台式高速离心机；烧杯；微量进样器；注射器；皮头滴管；刻度吸；培养皿（染色用）。 2.试剂：丙烯酰胺（Arc）；甲叉丙烯酰胺（Bis）；四甲基乙二胺（TEMED）；过硫酸铵（AP）；三羟甲基氨基甲烷（Tris）；甘氨酸（Gly）；琼脂粉；溴酚蓝； 甘油；联苯胺；醋酸；α-醋酸萘酯；β-醋酸萘酯；牢蓝RR盐；冰醋酸。 3.试剂的配制：见表1 五、实验步骤 1．样品的提取 称取1g不同处理的材料，加入少量提样缓冲液，置冰浴研磨成匀浆后定容至5ml，8000rpm离心6min，取上清液贮于冰箱备用。 2．凝胶制备： （1）取电泳玻板，用去污剂洗净，蒸馏水冲洗，直立干燥。洗净的玻板内面要避免手指触摸以防沾污。将玻板安装到电泳槽上。用电极缓冲液配制1.5%琼脂胶，沸水浴加热至琼脂完全溶化后，用皮头滴管沿板上部灌入两侧的封胶空隙，注意不要产生气泡。20分钟后凝固。 （2）按照表1中的A液：B液：水：C液=1：2：1：4的比例配置凝胶，混匀后用一细玻棒引流，缓缓注入胶室中，注胶过程防止气泡产生。胶液加到与凹槽相平时停止，插入预先选择好的样品梳，注意不要带入气泡。（本实验为A液：B液：水：C液=2.5：5：2.5：10） 3.点样及电泳： （1）向上下槽注入电极缓冲液，取下样品梳（不要拉断样槽隔墙）。将少许提取液与溴酚蓝指示剂以5：1混合。用微量进样器针头插入样槽下部慢慢进样。每槽点样30μl。 （2）上槽接负极，下槽接正级，接通电源，电流调至15~20mA，电压为200V，电泳至溴酚蓝标志到达凝胶前沿1 cm处，将电流、电压调至零后断电。 （3）电泳结束后，取下玻板，将两块玻板置自来水龙头下，借助水流，用解剖刀柄轻轻从板侧缝间撬开玻板（注意切忌从凹槽处撬），将胶放入染色液中。 4.染色： （1）过氧化物酶染色 联苯胺贮存液16ml（2g联苯胺溶于18ml文火加热的冰醋酸中，再加水72ml），0.6%过氧化氢16ml，水48ml。将胶板浸入此液中，待出现兰色条带后，弃去染色液用水洗涤保存。 （2）酯酶同工酶显色 称取30mg α-醋酸萘酯，30mgβ-醋酸萘酯，50mg坚牢蓝RR（或坚牢蓝B），先用约4ml丙酮溶解，再用0.1mol/L pH6.5的磷酸缓冲液稀释到60ml，将胶板浸入此液中，室温下显色约20min，可看到桃红色的磷酸酯酶同工酶区带。弃去染色液，用蒸馏水漂洗。 5.结果保存： 将脱过色的凝胶按照颜色深浅绘成的谱带图作为实验报告的凭证。 表1 试剂配方 溶液 配方 pH 浓度 A液 1mol/L盐酸 48ml Tris 36g 四甲基乙二胺（TEMED） 0.24ml 蒸馏水定容至100ml 8.9 7.5% B液 丙烯酰胺（Arc） 30g 甲叉丙烯酰胺（Bis） 0.8g 蒸馏水定容至100ml C液 过硫酸铵（AP） 1g 蒸馏水定容至100ml