Taqman探针方案要领.pptVIP

定量—— 绝对标准曲线方法 标准品：纯化的质粒dsDNA，体外转录的RNA 准确配制标准系列并且注意其稳定性，最好分装后保存于-80℃ 荧光材料：杂交探针、水解探针或SYBR Green I 不可以使用DNA作为标准品对RNA进行定量 应用于定量病毒荷载量等 定量—— 相对 标准曲线方法 指在测定目的基因的同时测定某一内对照基因，用一系列已知外参物做标准曲线，根据该标准曲线得到目的基因和内对照基因的量，再将目的基因的同内对照基因的比值作为定量的最后结果 标准品：含有目标基因的DNA或RNA 一般选用看家基因校正 常选择看家基因GAPDH 、β-actin、rRNA 在假设样品逆转录效率相同的前提下，可以使用DNA的标准曲线对RNA进行定量 较常用的一种方法 比较Ct法 假设目的基因与看家基因扩增效率相同，数学推导得出 目的基因的量=2-ΔΔCt ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)实验组-(Ct目的基因-Ct管家基因)对照 2-ΔΔCt表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数 在目的基因与看家基因扩增效率相同的情况下可以直接得到的目的基因相对于管家基因的定量，而不必制作标准曲线 更为简便省时，也是相当可靠的 重 复 性 问 题 判断实验结果优劣的重要指标 主要判断指标为标准差（SD）和变异系数（CV） 影响结果重复性的因素 PCR 反应扩增的效率 优化实验条件，使反应体系达到最佳扩增效率 目的基因的初始浓度 使用初始浓度具有较高数量级的样本或作平行孔 标准曲线的影响 5个稀释度的标准品，涵盖待测样本中目的基因量可能出现的全部浓度范围 理想的标准品应与样本具有高同源性 ：质粒DNA 或是体外合成、转录的RNA 影 响 敏 感 度 的 因 素 反应体系中形成的引物二聚体的影响 可以用水解探针代替SYBR Green I，有文献报导使用水解探针的敏感性要比SYBR Green I高出10倍。 可以使用热启动办法或使用特殊处理的Taq酶 要尽可能地优化引物设计 如果反应体系中出现PCR的抑制因素，应适当将目的基因的浓度稀释后再进行扩增。 注意避免室温混合各种试剂，并且在一经混合后立即开始进行扩增。 循环数 Mg2＋的浓度 应 用 对各种基因表达进行定量分析 基础研究：不同组织、用药前后、不同发育阶段基因表达 差异的检测 临床：细菌、病毒、寄生虫等病原体的检测 DNA、mRNA病毒荷载量的定量 肿瘤相关基因、肿瘤标志物和肿瘤耐药基因的检测 食品卫生检疫：转基因食品 瘟疫流行地区进口的食品 点突变分析和等位基因分析 单核苷酸多态性（SNP）分析 DNA甲基化检测 如何设计荧光定量PCR实验方案 根据拟要研究的基因名称，在genebank中找到相应的基因序列（） 采用引物设计软件Primer Express2.0 (Taqman探针或SYBR Green I，说明见/support/apptech ) 和beacon designs3.0进行引物探针的设计 软件可在下载 PCR产物大小在50-150bp TaqMan 探针设计原则 保持G-C含量在30-80%之间 避免同一碱基重复过多。特别是G，不可超过4个及以上 5’ 不能是G 尽量使探针中的C多于G 上述两条如果不能满足，则使用互补链上的探针 对于单探针反应，用Primer Express软件计算出来的Tm值应当在68-70℃ 之间，比引物高10℃。长度30bp 引 物 设 计 原 则 在探针确定以后再选择引物 引物要尽可能地接近探针，但是不要重叠 保持G-C含量在30-80%之间 避免同一碱基重复过多。特别是G，不可超过4个及以上 用Primer Express软件计算出来的Tm值应当在58-60 ℃之间 3’的5个碱基中G 和/或 C碱基的总数不能超过2个 引物和探针的设计原则的重要程度由上往下越来越低 如果是设计SYBR Green I引物，也要选择TaqMan Primer and Probe design并遵守这些规则，但是只需要合成引物就可以了。 为了确保引物和探针的特异性，最好将设计好的序列在www.ncbi.nlm.nih/blast 中核实一次，如果发现由非特异性互补区，建议重新设计引物探针。 如何设计荧光定量PCR实验方案 根据仪器和个人的喜好，确定荧光定量PCR的方法，选择荧光素的种类 合成引物和探针 收集样品、提取RNA或DNA（-80℃保存，避免反复冻融 ） 制备标准品（质粒、化学合成的目的基因） 拷贝