第五章sh化outi.pptVIP

㈡ 化学（裂解）法(如图) 在无NaCl下，用联氨（肼）可打开C、T碱基，在C、T碱基发生断裂，形成T+C组。加入NaCl，肼切割C形成C组。在中性条件下，硫酸二甲酯可在G处断开形成G组。加入甲酸可在A、G处断开，形成G+A组，最后电泳经感光读片，自动分析得到测序结果。如、图5-9 5-10 全自动DNA测序仪 末端终止法，采用4种荧光染料标记ddNTP，在同一泳道测序，为人类基因组测序做出重大贡献。 3’GACTGAAGCTGTT5’ ： 四类核酸分子杂交法的技术路线比较 菌落原位杂交 菌落或噬菌斑转印到膜上 抽提DNA/RNA 提取DNA 提取RNA 裂解细菌或噬菌斑 变性核酸样品 琼脂糖凝胶电泳 变性DNA 将核酸点加到膜上 将凝胶上核酸条带转移到膜上，同时变性 将核酸固定在膜上→预杂交（消除非特异吸附位点）→加入核素标记探针进行杂交→漂洗膜（洗去非特异结合探针） →放射自显影或显色反应示踪 斑点杂交 Southern印迹 Northern印迹 重组子的筛选与鉴定 （一）根据重组DNA分子特征(DNA水平) 1.根据重组DNA分子大小鉴定 2.根据重组DNA分子酶切图谱鉴定 3.根据PCR扩增片段鉴定世隔绝 4.采用DNA杂交鉴定：Southern印迹、斑点印迹、菌落原位杂交 5.应用DNA芯片鉴定 6.根据DNA核苷酸序列鉴定 （二）根据目的基因转录产物(mRNA水平):Northern印迹 （三）根据目的基因翻译产物(protein水平) 1.蛋白质凝胶电泳法鉴定重组子 2.免疫检测法鉴定重组子:酶联免疫吸附试验(ELISA)、Westhern印迹法 α互补的检测 原位杂交 Southern 印迹 三种印迹技术的比较 分子杂交实验 ① ② ③ 目 录 重组DNA导入宿主细 胞与转化子的筛选 第一节??????? 重组DNA向宿主细胞的导入 第二节??????? 转化子的筛选与鉴定 第三节??????? 目的基因序列测定 第一节??????? 重组DNA向宿主细胞的导入 一、转化 二、通过接合作用传递质粒DNA 三、通过转染/转导作用传递遗传物质 一、转化 : 以质粒作为克隆载体将目的基因导入宿主细胞 1928年, 美国的Oswald, Avery 首次开展了肺炎球菌的转化试验 感受态细菌是指细菌处于容易接受外源DNA的状态。有的细菌在生长周期任何时候自动产生如枯草、嗜血杆菌。有的在对数生长期发生，如E.coli。产生机制不明。一是原生质体假说，另一是酶受体假说。 转化作用就是一种基因型细胞（感受态细菌）从周围介质中吸收来自另一种基因型细胞的DNA, 进而使原来细胞的遗传基因和遗传性发生相应变化的现象。常见转化方法有㈠ 原生质体转化法； ㈡ 化学转化法； ㈢电穿孔法。 ㈠ 原生质体转化法: 除去细胞壁后加外源DNA，经吸收恢复再生培养，如枯草杆菌。 ㈡ 化学转化法: 1970年Mandel和Higa首先用CaCl2经短暂的热休克后，可使外源DNA转入E.coli。 1.原理：将对数生长期的细菌在0℃下, 用预冷的CaCl2溶液低渗处理, 以使菌体的细胞壁和细胞膜通透性增加, 菌体膨胀成球形。DNA易于进入细菌的细胞内 。 用冷CaCl2低渗处理E.coli使菌体成球形，外源DNA可形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物而被吸附，经短暂42℃热休克，易于进入胞内而不被降解，转化效率达105-106。 2.方法 : （1）感受态细菌的制备 （2）转化 （1）感受态细菌的制备 接种一环DH5?于2ml LB中 37℃，振荡过夜 以约1%的接种量接入20ml LB中 振荡培养约90’至OD600≈0.2 离心（5K，5’） 收集菌体 加入预冷CaCl2（10 ml 100mM） 混匀冰浴20’ 离心 收集菌体 加入100ul100mM预冷CaCl2 混匀 转化项目 CaCl2 受体菌 DNA 液体LB 皿 a阳性对照 —— 100ul PBR322DNAlng 600ul ? b阴性对照① 10ul —— 2ul连接液 600ul ? c阴性对照② —— 100ul —— 600ul ? d连接液转化组 —— 100ul 6ul连接液 600ul ? （2）转化： 0℃，在1.5ml离心管中按下表加入CaCl2、受体菌及DNA进行转化实验 冰浴30’ 42℃，2’（热休克