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牙周病分子生物学Molecular Biology of Periodontal Diseases 一、概述 二、牙周病的分子致病 　　1.微生物的毒力因子 　　2.宿主因子 三、核酸杂交法检测牙周病有关细菌 定义（Definition） 分子生物学技术研究与牙周病密切相关生物大分子（蛋白、核酸）的一门新兴学科──前瞻性、交叉性。 研究内容 宿主基因水平或分子水平阐明牙周病发病机制和流行规律 牙周病原菌的蛋白和核酸(DNA、RNA)分子结构──追踪病原菌传播途径、发现病原体变异。 牙周病的发生发展规律与微观的病原菌或宿主基因特征联系起来──牙周病临床的分子诊断、分子指征、分子预后乃至基因治疗 牙周病的分子致病 Molecular Pathogenesis of Periodontal Disease 微生物的毒力因子 研究牙周病原菌的蛋白和核酸分子结构，评价毒力因子的作用。 宿主因子 研究细胞因子和遗传因子的作用。 微生物的毒力因子 Microbial Viralence Factors 内毒素(lipopolysaccharide, LPS) G-菌胞壁外膜的脂多糖成分（磷脂－多糖－蛋白质）。 十二烷基磺酸钠－聚丙烯凝胶电泳 SDS gel 银染色Silver stain 内毒素－免疫印迹LPS-immuno-blotting 牙龈素(gingipains) 最初称为胰酶样蛋白酶(trypsin-like protease, TLP),又称卟啉素(porphypains) 存在于Pg的外膜、膜泡或胞外的一组蛋白酶 超速离心(10000g×20min,4℃)提取胞外膜泡——高凝胶液相色谱法(GF-HPLC)分离纯化。 精氨酸－牙龈素(Arginine-gingipains, Rgps):特异性切断蛋白质与精氨酸残基结合的肽段，由rgpA(前肽区、蛋白酶区、粘附区)和rgpB(无粘附区)二个基因编码 赖氨酸－牙龈素(Lysine-gingipain, Kgp):特异性切断蛋白质与赖氨酸残基结合的肽段，由kgp(前肽区、蛋白酶区、粘附区)单个基因编码 Pg同源突变株的性状改变 突变株 性状改变 rgpA 粘附能力部分丧失 降解I型胶原能力丧失 rgpA、rgpB 抑制中性粒细胞功能丧失 菌毛缺失 kgp 菌落无法变黑(影响利用血红蛋白) rgpA、rgpB、kgp 胞外蛋白水解活性丧失 牙龈素功能 有助于粘附定植：对纤维蛋白的亲和力。 毒性作用：破坏宿主组织细胞的活性成分(蛋白、多肽)、降解胶原；促进缓激肽释放，提高血管通渗性，增加龈沟液量，组织水肿。 帮助细胞生长：将组织蛋白质降解为短肽链，扩大细菌营养摄取范围，为细菌生长和毒力发挥提供养分。 干扰宿主免疫反应：影响中性白细胞功能，降解宿主细胞的LPS受体CD14，降解细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8及TNFα等。 菌毛亚单位蛋白结构基因(fim A) 粘附有关的毒力因子── 纤毛素(fimbrilin) 粘附素(adhesin) 血细胞凝集素(hemagglutinin) 1988年Dickinson等首先获得含编码Pg纤毛素基因的克隆质粒PUC 13Bg12.1，该基因为染色体上的单拷贝基因，它的氨基酸序列与其他菌毛无同源性，可利用该特异基因作探针鉴定Pg，可进一步研究Pg菌毛的致病作用。 胶原酶基因(prtc) Pg的胶原酶能降解I型胶原，破坏牙周组织附着。 已测知表达胶原酶活性的prtc基因序列，它存在于Pg的三种主要血清型中，编码1个37501.38μ蛋白质。 白细胞毒素基因(lkt A、B、C、D) Aa是口腔中唯一能产生白细胞毒素(leukotoxin,LKT)的细菌，白细胞毒素仅能杀死人或灵长类的多形核白细胞、单核细胞和巨噬细胞，抑制破坏宿主的免疫防御机制。 现已克隆和测知lkt A的序列，且在受体菌中得到表达。编码毒素结构，激活白细胞毒素。 宿主因子 Host Factors 细胞因子(cytokines) 细胞生物学 细胞因子 cytokine(CK) 免疫学 淋巴因子 lymphokine  interleukincytikine(LI) 血液学 集落刺激因子 colony stimulation  fac